目的:利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-QE-Orbitrap-MS)分析三棱提取物在大鼠体内的入血成分。方法:采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8μm),以0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，流速0.2 mL·min-1,进样量5μL。质谱分析采用电喷雾离子源，在正、负离子模式下采集数据，扫描范围m/z 100～1 000。采用Compound Discoverer 3.0软件获取特征碎片离子信息，结合数据库(mzCloud, mzVault、OTCML数据库及文献确定入血成分。结果:综合质谱检测信息，从三棱药材提取物中解析出70个化学成分，大鼠口服给药后，含药血浆中分析出40个成分，包括20种原型成分和20个代谢产物，其主要代谢途径分别为甲基化、去甲基化、还原反应、葡萄糖醛酸化等。结论:本文采用UPLC-QE-Orbitrap-MS技术分析鉴定了三棱主要入血成分及部分代谢产物，为阐明三棱的药效物质基础和质量控制奠定基础。
动物：
2.1 三棱提取物的制备
精密称取三棱药材100 g, 粉碎，过4号筛，置1 000 mL圆底烧瓶中，加入80%甲醇500 mL,加热回流提取2次，每次1 h, 放凉、过滤，旋蒸后水浴蒸干，加水复溶，定容至100 mL容量瓶，即得三棱提取物[8]。
2.2 给药和样本采集
2.2.1 含药血浆样本的采集
取6只SD大鼠作为给药组，每只大鼠用“2.1”项下三棱提取物灌胃，给药剂量2 g·kg-1(按正常成年人50 kg计算相当于临床等效剂量的10倍，以生药量计);早晚各1次，连续灌胃3 d, 末次给药后禁食不禁水12 h, 第4天灌胃后分别在10,15,30,45,60,90,120,180 min在大鼠眼内眦静脉丛取血0.5 mL,各时间点血浆样品等体积混匀后，放置于EDTA抗凝管中，12 000 r·min-1离心10 min(离心半径83 mm),取上清液，即得含药血浆样本。
2.2.2 空白血浆样本的采集
取6只SD大鼠为空白组，每只大鼠灌胃相同剂量的生理盐水，灌胃2 h后在大鼠眼内眦静脉丛取血0.5 mL,放置于EDTA抗凝管中，12 000 r·min-1离心10 min(离心半径83 mm),取上清液，既得空白血浆样本。
2.3 血浆样本的处理与分析
取“2.2.1”和“2.2.2”项下血浆样本100 μL,分别置于离心管中，加3倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋振荡1 min, 12 000 r·min-1 离心10 min, 取上清液200 μL,进行UPLC-QE-Orbitrap-MS分析。
2.4 色谱及质谱条件
Waters ACQUITY UPLC HSS T3C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),流动相为0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0～10 min, 100%B;10～20 min, 100%→70%B;20～25 min, 70%→60%B;25～30 min, 60%→50%B;30～40 min, 50%→30%B;40～45 min, 30%→0%B;45～60 min, 0%B;60～60.1,0→100%B;60.1～70 min, 100%B),流速0.2 mL·min-1,进样量5 μL,柱温30 ℃。采用加热电喷雾离子源(HESI),检测模式为正、负离子Full MS-ddMS2,分辨率70 000,鞘气流速设定40 L·min-1,辅助气流量15 L·min-1,裂解电压3.20 kV,离子传输管温度320 ℃,辅助气温度350 ℃,扫描方式采用全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS-ddMS2),质谱扫描范围m/z 100～1 000,碰撞能梯度为20,40,60 eV。
2.5 统计学处理
采用CD 3.0软件进行raw文件特征峰提取，并采用mzCloud, mzVault和OTCML数据库同时进行特征峰鉴定，筛选标准为最佳匹配得分>80分，对筛选后目标化合物的质谱信息与相关文献对比，进行化合物分析鉴定。
【结果部分】
1.质谱总离子电流图
2.成分鉴定结果：
3.代谢产物
转自：“如沐风科研”微信公众号
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