白芍Paeoniae Radix Alba作为大宗中药品种，始载于《神农本草经》，其味苦、酸，性微寒，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等功效[1]。由于白芍“酸寒伐生发之气”，易使寒症加重，故脾胃虚寒、血虚兼凝血者不宜服用，因此，在临床应用中通常需通过酒炒、清炒、土炒等炮制方法改变或缓和其酸寒药性，其中酒炙白芍，可借酒温升散寒，降低其酸寒伐肝之性，在《本草纲目》中有记载：“芍药……性味酸寒，冬月必以酒炒，凡腹痛多是血脉凝涩，亦必酒炒用”[2]。现代研究亦表明，酒白芍与其他炮制品在临床功效以及药理作用上与白芍生品相比均有所差异[3-4]，表明其炮制前后的化学成分也有所不同。
目前，对白芍的研究多集中在不同的加工方式与药材品质之间的关系[5-6]，以及产地不同的药材其质量的相互比较等方面[7]，对于其酒炙前后化学成分与功效变化等相关研究不充分，不利于白芍酒炙前后的区分以及其临床上用药质量的控制。基于此，本实验以生白芍与酒白芍饮片为研究对象，建立HPLC指纹图谱，结合化学计量学对白芍酒炙前后进行区分，筛选酒炙前后主要差异性标志物，并进行定量分析，对白芍酒炙前后的化学成分变化进行初步研究，从而为后续白芍酒炙炮制机制、质量控制，以及其在临床上应用等方面的研究提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
EX125DZH型万分之一电子天平，美国奥豪斯仪器有限公司；EX-H3052型百万分之一微量分析天平，上海赞维衡器有限公司；Thermo Fisher Ulti Mate3000高效液相色谱仪，LPG-3400SDN四元泵，DAD-3000检测器，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；JK-300DB型超声波清洗器，合肥金尼克机械制造有限公司。
1.2 药材
10批生白芍饮片经安徽中医药大学俞年军教授鉴定，均为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根加工炮制品，部分酒白芍饮片参考《中国药典》2020年版[1]由实验室自行炮制，含水量均小于14%，符合《中国药典》2020年版规定，样品信息详见表1，编号B1～B10为生白芍饮片，编号J1～J10为酒白芍饮片。其中B1炮制为J3、J4，B2炮制为J5，B3炮制为J6，B4炮制为J7，B5炮制为J8、J9，B7炮制为J10，其余饮片均为购买所得。
1.3 试剂
对照品没食子酸（批号DSTDM000802，质量分数99.99%）、氧化芍药苷（批号DST220707-074，质量分数99.57%）、芍药内酯苷（批号DST220412- 071，质量分数98.18%）、没食子酰芍药苷（批号DST220520-064，质量分数98.68%）、芍药苷（批号DSTDS007002，质量分数98.71%）、苯甲酰芍药苷（批号DST220601-053，质量分数98.79%）、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖（批号DSTDW000102，质量分数99.33%），以上对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。
乙腈和甲醇为色谱纯，购于美国Tedia公司；水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其余试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液 精密称取对照品没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷适量，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，得每1 mL含没食子酸50.2 μg、氧化芍药苷107.2 μg、芍药内酯苷105.8 μg、芍药苷100.6 μg、没食子酰芍药苷100.4 μg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖120 μg、苯甲酰芍药苷107.4 μg的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液[8] 精密称定各批次生、酒白芍饮片样品粉末（过四号筛）0.1 g，置50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超声处理（功率240 W、频率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件
色谱柱为Aglient Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，5%～9%乙腈；5～8 min，9%～15%乙腈；8～23 min，15%～25%乙腈；23～28 min，25%～35%乙腈；28～35 min，35%～90%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为10 μL；采用切换波长法，1～12.85 min检测波长为257 nm，12.85～35 min检测波长为230 nm。色谱图见图1。
2.3 白芍酒炙前后指纹图谱的建立
2.3.1 精密度试验 取生白芍饮片样品（B1），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以芍药苷（峰7）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.06%，相对峰面积RSD为1.01%～2.73%，表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取生白芍饮片样品（B1），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，以芍药苷（峰7）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.06%，相对峰面积RSD为1.27%～2.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验 取生白芍饮片样品（B1）6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，以芍药苷（峰7）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.08%，相对峰面积RSD为0.59%～2.79%，表明此方法重复性良好。
2.3.4 指纹图谱的建立及共有峰的标定 分别将10批生白芍（B1～B10）、酒白芍（J1～J10）饮片，以“2.1.2”项下的步骤配置为待测样品，进行检测，将得到的各样品图谱分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）软件进行图谱分析。分别以B1和J1作为参照图谱，采用“中位数法”，时间宽度设定为0.1 min，进行多点校正和全谱峰匹配，生成对照色谱图（R），最终分别建立生、酒白芍饮片样品指纹图谱。其中10批生白芍与酒白芍指纹图谱中均标定10个主要共有峰（主要共有峰的总面积均占样品总峰面积的80%以上），结果如图2所示。
2.3.5 相似度评价[8-10] 10批生白芍（B1～B10）、酒白芍（J1～J10）指纹图谱，以对照图谱R为参照，其相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.998、0.999、1.000、0.999、0.999和0.999、0.999、0.997、0.999、0.999、0.998、1.000、0.999、0.996、0.999，分别在0.998～1.000与0.996～1.000，相似度均大于0.99，可分别表明二者品质均较为一致，相对稳定。
同时再运用相似度评价软件，将白芍酒炙前后所有批次饮片样品（B1～J10）色谱图导入其中，计算其相似度分别为0.998、0.998、0.997、0.999、0.998、0.996、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.997、0.998、0.998、0.998、0.999、0.999、0.998、0.992、0.999，均大于0.9，表明白芍酒炙前后其二者各自指纹图谱相似性较好，但并不能体现出白芍酒炙前后的区分性及质量差异，无法有效区分生白芍饮片和酒白芍饮片。由于指纹图谱中主要峰群的整体相似，因此需要进一步分析其共有峰以及采用化学计量学分析其差异与主要差异性标志物。
2.3.6 生白芍与酒白芍指纹图谱共有峰的差异性分析 通过与混合对照品色谱图中各色谱峰保留时间进行比对，指认出生白芍与酒白芍指纹图谱中的7个共有峰，分别为峰1（没食子酸）、2（氧化芍药苷）、6（芍药内酯苷）、7（芍药苷）、8（没食子酰芍药苷）、9（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖）、10（苯甲酰芍药苷）。生白芍与酒白芍饮片指纹图谱中共有峰的相对峰面积见表2，所得结果采用SPSS 24.0软件进行独立样本t检验，并运用GraphPad Prism 8软件，绘制小提琴图（violin plot，图3），可直观形象地观察和对比出白芍饮片酒炙前后10个共有峰的峰面积变化。由图3结果可得，白芍酒炙后峰1与峰9的峰面积呈现出不同程度地增加趋势，且峰1具有显著性变化差异；其余峰的峰面积呈现出不同程度地减少趋势，其中峰2～4、7、8、10具有显著性变化差异。
2.4 化学计量学分析
2.4.1 层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）白芍饮片酒炙前后的差异[11-12] 采用SIMCA 14.1对所有样品10个共有峰相对峰面积为变量，进行HCA，所得结果如图4所示。当聚类距离为20～25时，20批样品可明显聚为生白芍及酒白芍2类，其中B1～B10为一类，J1～J10为一类，HCA结果表明，白芍酒炙前后可明显分为2类，其成分含量存在一定差异，而在其中生白芍与酒白芍各自不同批次之间又存在一定差异，其原因可能与饮片药材收集的原产地、采收时间以及其炮制工艺存在一定的差异。
2.4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）白芍饮片酒炙前后的差异[13-14] 采用SPSS 24.0和SIMCA 14.1统计软件，以上述B1～J10白芍酒炙前后样品10个共有峰相对峰面积为变量，进行PCA，得B5批次样品分析结果在置信区间之外，故PCA暂将B5样品剔除不作分析。其余样品分析后可得抽样适合性检验（Kaiser Meyer Olkin，KMO，检验值≥0.6）和巴特利特球形检验（Bartlett，检验值≤0.05），表明本研究所得结果可以用于进行PCA；其主成分特征值和贡献率，以及主成分矩阵所得结果如表3、4所示。
由表3可得，特征值大于1时，可得出主成分3个，累积方差贡献率为72.930%，说明这3个主成分可以客观的反映生白芍和酒炙白芍与10个共有峰之间的关系。由表4可知，主成分1与峰1～3、6～8、10有较好的相关性，主成分2与峰4、9有较好的相关性，主成分3与峰5有较好的相关性，因此，在PCA中其3个主成分能够较好地代表生白芍与酒白芍样品饮片中大部分成分的信息，故选取主成分1～3进行PCA，得其主成分得分图，结果见如图5。由图5可得，白芍酒炙前后样品总体可明显聚为2类。其中B1～B10为一类（未含B5），J1～J10为一类，其结果与上述HCA结果一致，表明白芍酒炙前后存在一定差异。
2.4.3 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）白芍饮片酒炙前后主要差异性标志物[15-16] 采用SIMCA 14.1对所有样品10个共有峰相对峰面积为变量，进行OPLS-DA，以确定白芍饮片酒炙前后的主要差异成分，结果见图6、7。如图6所示，白芍酒炙前后样品，可明显分为2组，生白芍B1～B10与酒炙白芍J1～J10各为1组，这与PCA结果一致；如图7所示，峰1（没食子酸）、2（氧化芍药苷）、3、7（芍药苷）、8（没食子酰芍药苷）的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值大于1，提示以上5种成分为白芍饮片酒炙前后的主要差异成分，且通过上述Violin Plot可得，该5种成分在白芍饮片酒炙前后均会发生显著性变化，即P＜0.05，可作为白芍酒炙前后的差异性标志物。
综合上述分析，筛选得5种差异性标志物，其中可指认出4种差异性标志物分别为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、没食子酰芍药苷；而在白芍饮片中氧化芍药苷含量过低，不易准确测定，故后续选取其可指认且含量较高可准确测定的没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷等3种成分进行定量分析。以期相对全面、客观地分析白芍酒炙前后差异性标志物变化情况。
2.5.1 线性关系考察 取3种成分对照品，精密称定，以“2.1.1”项下步骤配制6个不同质量浓度的对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件检测，分别以峰面积与质量浓度为纵、横坐标进行线性回归，得回归方程分别为没食子酸Y＝0.114 3 X＋3.673 8，R2＝0.999 2，线性范围2.53～101.00 μg/mL；芍药苷Y＝0.225 6 X－0.051 7，R2＝0.999 9，线性范围5.06～101.20 μg/mL；没食子酰芍药苷Y＝0.048 8 X－0.027 4，R2＝0.999 6，线性范围2.04～40.80 μg/mL；结果可得各对照品线性关系良好，R2均在0.999以上。
2.5.2 精密度试验 取对照品没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷质量浓度分别为50.2、100.6、100.4 μg/mL的混合对照品溶液，连续进样6次，得没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷峰面积的RSD分别为0.790%、0.951%、0.503%，表明仪器具有良好的精密度。
2.5.3 稳定性试验 取生白芍饮片样品（B1），按照“2.1.2”项下方法步骤配制供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h检测进样。其结果可得，没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷峰面积的RSD依次为0.658%、1.154%、0.785%，得其溶液在24 h内稳定性良好。
2.5.4 重复性试验 取同一批生白芍饮片样品（B1）6份，按照“2.1.2”项下的步骤方法配制供试品溶液，之后进样。其结果可得，没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷质量分数平均值依次为0.165%、2.844%、0.135%，RSD分别为1.979%、1.356%、2.320%，表明此方法具有良好的重复性。
2.5.5 加样回收率试验 取已测定3种指标成分含量的样品（B1）6份，每份约0.05 g，精密称定，以1∶1比例加入没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷对照品适量，之后进样检测，得加样回收率考察结果。结果没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷的平均加样回收率分别为98.82%、102.50%、103.00%，RSD分别为2.94%、2.15%、2.08%，可得此方法具有良好的准确度。
2.5.6 样品测定 对10批生白芍饮片样品与10批酒白芍饮片样品进行含量测定，按照“2.1”项下步骤方法配制对照品溶液和供试品溶液，按“2.2”项下所述的色谱条件进样分析，计算供试品溶液中3种可指认且含量较高可准确测定的主要差异性标志物没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷的含量，结果见表5。
同时将测定结果导入微生信在线平台（www. bioinformatics.com.cn），绘制聚类热图[17]，同时结合SPSS 24.0软件对其进行独立样本t检验分析，结果见图8，可直观形象地观察和对比白芍饮片酒炙前后该3种成分含量变化趋势，区分生白芍与酒炙白芍饮片的质量差异。结果显示，白芍酒炙后没食子酸含量显著性升高，芍药苷、没食子酰芍药苷含量显著性下降，该3种成分酒炙前后呈现出明显差异（P＜0.01），同时通过聚类热图可将白芍酒炙前后分为两类，分类结果与HCA结果一致，表明该3种成分可以作为区分生白芍与酒白芍质量控制与鉴别的质控指标。
3讨论
3.1 指纹图谱差异性研究
本研究建立了生白芍饮片与酒炙白芍饮片的HPLC指纹图谱，通过相似度评价可得，单独生白芍饮片与酒炙白芍饮片整体质量相对稳定，但无法反映白芍酒炙前后的区分性及质量差异；后续进行共有峰差异性分析得出白芍酒炙前后各共有峰峰面积的差异性变化，并进一步利用化学计量学等方法，分析白芍饮片酒炙前后指纹图谱差异，通过HCA可明显把生白芍与酒炙白芍分为2类，其结果与PCA结果互相印证，表明白芍酒炙前后存在一定差异，OPLS-DA结果表明峰1（没食子酸）、2（氧化芍药苷）、3、7（芍药苷）、8（没食子酰芍药苷）为二者质量差异的主要代表成分，且通过酒炙前后均会发生显著性变化，即P＜0.05，可作为区分生白芍饮片与酒炙白芍饮片的差异性标志物。
其中，对白芍酒炙前后各共有峰差异变化进行分析，发现白芍酒炙后，除峰1（没食子酸）与峰9（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖）峰面积增加外，其余成分峰面积均呈现下降趋势；结合Xiong等[18]采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS对中药白芍中鞣质进行鉴定的报道中发现白芍中含有多种水解鞣质，可在酸、碱、酶等条件下逐步发生水解，因此推测本实验中鞣质类成分峰1（没食子酸）与峰9（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖）峰面积增加，其原因可能是，在酒炙过程中某一可水解类鞣质水解，使之有所增加，同时峰1（没食子酸）增加具有显著性，可能为白芍在炮制过程中，黄酒中原有成分的引入以及部分峰9（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖）可继续水解产生峰1（没食子酸），进而使其显著性增加。而其余成分峰面积呈现下降的趋势，可能原因为在酒炙过程中，受热不稳定，使其结构遭到了破坏，进而使其响应值降低，如白芍中所含的化学成分峰7（芍药苷）以及其相似的化合物，峰8（没食子酰芍药苷）等，可能在炒制过程中，其高温条件下分别使其醚苷键与酯苷键断裂，而生成其他化合物[19-20]；该些成分以及发生转化的具体机制还有待进一步验证研究。
3.2 差异标志物含量研究
白芍所含化学成分繁杂多样[21]，研究发现其所含成分芍药苷可减少炎症因子的生成，并可使正常的细胞信号传导得到恢复，从而发挥抗炎的作用，同时还可通过腺苷A1受体发挥镇痛作用，此外，芍药苷还可抑止活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和NADPH氧化酶4（NOX4）的表达，并通过激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路，使得核因子E2相关因子2（nuclearfactor- E2-relatedfactor 2，Nrf2）表达上调，进而通过抗氧化机制缓解胆汁淤积，进而起到保肝等药理作用[22-24]，为白芍发挥柔肝止痛功效的主要物质基础之一；所含成分没食子酰芍药苷与没食子酸，则分别可通过抑制血管内皮细胞的增殖进而抑制血栓的形成与舒张血管[25-26]，发挥白芍养血活血等功效，同时没食子酸还可降低其肝脏中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力进而具有一定的保肝作用。该3种成分与白芍功能主治密切相关，且在白芍酒炙前后主要差异标志物中含量较高，因此，对筛选出的此3种主要差异标志物进行定量分析。根据含量测定结果与聚类热图可直观得出，白芍酒炙后没食子酸含量显著性升高，芍药苷与没食子酰芍药苷的含量显著性下降；3种成分均有显著性差异变化，同时通过聚类热图仍可将白芍酒炙前后分为2类，与化学计量学分析结果一致，进一步证实了选择该3种成分作为白芍酒炙前后差异性标志物的合理性，可为后续进一步探究功效变化机理与酒炙前后质量控制提供科学参考。
4 结论
白芍作为大宗中药品种，酒炙是其主要的炮制方法之一，借助酒温升散寒，缓和其酸寒伐肝之性，增强其养血调经、柔肝止痛等功效。现有研究表明，生物碱和苷类成分是具有苦寒之性药物的物质基础[22]，而白芍中富含单萜苷类成分，结合本研究中发现白芍酒炙后会使单萜苷类成分芍药苷、没食子酰芍药苷等成分含量降低，推测这可能与白芍酒炙后寒性下降有着一定的联系，其炮制机制，有待进一步深入探究；同时没食子酸有一定的活血与保肝的作用，酒炙后其在饮片中含量升高，与白芍酒炙后养血保肝等功效的增强具有一定的相关性，其含量升高可能与没食子酸鞣质类成分在酒炙过程中水解有关。
本研究对于白芍酒炙前后化学成分的辨析尚存在不足，暂未明确峰3、4、5所对应的化学成分，后期将采用色谱-质谱联用等方法进一步对未知成分进行鉴定；同时结合药理药效实验进一步研究白芍酒炙前后成分变化及其功效变化的相关性。综上所述，本研究基于指纹图谱结合化学计量学对比研究了白芍酒炙前后的差异性，并筛选出二者差异性标志物，可为白芍酒炙前后饮片的质量控制和品质评价提供参考，同时对二者差异性标志物进行定量分析，对白芍酒炙前后中化学成分变化情况进行了初步探究，为白芍酒炙前后炮制机制及临床应用的深入研究提供科学依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：李鹏飞，岳倩侠，孙叶芬，江栋梁，佟沫儒，金传山，张 伟，李培培，罗 云．基于指纹图谱与化学计量学的白芍酒炙前后差异性标志物研究 [J]. 中草药, 2023, 54(8):2398-2407.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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