肝纤维化是慢性肝病肝实质损伤后过度修复的过程，以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积为主要特征，进一步发展为肝硬化甚至肝癌[1]，是威胁人类健康的重要公共卫生问题。目前西医尚无针对肝纤维化的特效药物，近年来研究发现中医药可控制甚至逆转肝纤维化[2]，值得深入发掘。中医认为，肝纤维化属络病范畴，其病以邪毒瘀血痰浊等为标，正气亏虚为本，正虚络阻是其基本病机，因此治疗应以扶正通络法，其中尤以“扶正”为治疗的关键。在肝纤维化的治疗中，黄芪是益气健脾扶正的常用药物[3]。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根。《中国药典》载其“味甘，微温，归肺、脾经，生黄芪补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓和敛疮生肌的功效，蜜炙黄芪益气补中”。黄芪常用于肝纤维化的治疗，本课题组前期依据首届全国名中医张之文教授的临床经验，由温病专家冯全生教授创芪甲柔肝方，该方以黄芪为君药，临床治疗肝纤维化疗效显著[4]。研究发现黄芪抗肝纤维化的作用可能与调节免疫有关[5]。
黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黄芪的主要成分之一，其分子式为C41H68O14，是黄芪质量鉴定中重要的评价指标[6-7]。现代研究发现，AS-Ⅳ在肾间质纤维化[8]、肺纤维化[9]、心肌纤维化[10]等多种纤维化疾病中发挥重要作用。近年来发现AS-Ⅳ具有抗肝纤维化的作用[11-12]，可抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化及胶原产生[13-14]，但机制仍有待进一步揭示。因此，本研究拟开展动物实验，从CXC基序趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）/CXC基序趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）信号轴、硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性体路径的角度揭示AS-Ⅳ抗肝纤维化的分子机制。
1 材料
1.1 动物
清洁级雄性SD大鼠48只，6周龄，体质量（190±10）g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（川）2015-030。动物于室温（22±2）℃、相对湿度50%的环境下，适应性喂养1周。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（批准号2022-32）。
1.2 药品与试剂
AS-Ⅳ（批号AIV-98-200203，质量分数为99.54%）购自成都锦泰和医药化学技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）测定试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，货号为105-000442-00和105-000443-00；血清III型前胶原氨基端原肽（Ⅲ procollagen amino-terminal peptide，PⅢNP）、IV型前胶原（procollagen type Ⅳ，PCⅣ）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）和层黏蛋白（laminin，LN）试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司，货号分别为S20093002、S20090004、S20083010和S20080004；β-actin和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗购自美国CST公司（货号为3700S和19245）；I型胶原（Collagen Ⅰ）、CXCR4、CXCL12、NLRP3、TXNIP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）一抗购自英国Abcam公司，批号为GR3297275-2、GR3231217-1、GR3323838-1、GR3197814-8、GR3232708-8、GR309542-28；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）一抗（批号sc-514414）购自Santa Cruz Biotechnology公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉，货号为ZB-2301和ZB-2305；RNAprep Pure Tissue Kit（DP431）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）购自宝日医生物技术（北京）有限公司，货号为RR047B和RR820A；BCA蛋白检测试剂盒（批号23325）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 仪器
RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；DS-U3型成像系统（日本Nikon公司）；JJ-12J型冷冻离心机、JB-P5型PCR仪、Quant studio 7flex qRT-PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；VersaDoc 3000型凝胶成像仪成像（美国Bio-Rad公司）；BS-240VET型全自动生化仪（Mindray公司）。
2 方法
2.1 造模、分组及给药
SD大鼠适应性喂养1周后，随机将其中10只大鼠设为空白组，采用sc 40%四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）花生油联合10%乙醇饲喂的方式对剩余的38只大鼠构建肝纤维化模型，持续8周，分别于第4、6、8周末处死2只小鼠进行肝组织苏木素-伊红（HE）、Masson染色以判断造模效果。造模成功后将所有肝纤维化大鼠随机分为模型组（n＝8）、AS-IV高剂量组（40 mg/kg，n＝10）和AS-Ⅳ低剂量组（20 mg/kg，n＝10）[15-16]。AS-Ⅳ溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液，各给药组ig相应药物（10 mL/kg），空白组和模型组ig等体积的生理盐水，1次/d，连续6周。
2.2 取材
治疗6周后，所有大鼠禁食禁水1 d后取材。大鼠ip 3%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）麻醉后，心脏采血7 mL，分离血清，用于检测肝功能、血清纤维化标志物等指标。取肝脏，称定质量并记录，观察肝脏颜色及质地并拍照，取数块肝组织液氮速冻，用于Western blotting、qRT-PCR检测；另取一块肝组织置于4%多聚甲醛中固定，用于HE及Masson染色及免疫组化。
2.3 血清学指标检测
按照试剂盒说明，用放射性免疫法检测大鼠血清中PⅢNP、PCⅣ、HA和LN水平，采用全自动生化仪检测大鼠血清中ALT、AST活性。
2.4 肝组织病理学观察
2.4.1 HE染色 大鼠肝组织经多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水洗，然后用苏木素染细胞核、伊红染细胞质，再依次用95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱水、封片，于显微镜下观察并拍照。肝脏炎症分级参照Scheuer评分系统。
2.4.2 Masson染色 大鼠肝组织经多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、75%乙醇、自来水洗，然后依次用重铬酸钾、铁苏木素、丽春红酸性品红、磷钼酸、苯胺蓝染色，再用1%冰醋酸分化，两缸无水乙醇脱水、封片，于显微镜下观察并拍照。纤维化评分参照Metavir评分系统。
2.5 免疫组化检测肝组织α-SMA及Collagen I蛋白表达
大鼠肝组织经多聚甲醛中固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水洗，置于柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。将玻片置于PBS中洗涤3次，放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，PBS洗涤3次。在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白均匀覆盖组织，室温封闭30 min。轻甩掉封闭液，滴加Collagen Ⅰ、α-SMA一抗（稀释比例为1∶400、1∶2000），4 ℃孵育过夜。玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，稍甩干后在圈内滴加HRP标记的山羊抗兔二抗覆盖组织，室温孵育50 min。PBS中洗涤3次。稍甩干后加DAB显色液显色，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。然后以苏木素复染3 min，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ中脱水透明，稍晾干，中性树胶封片。于显微镜下观察并拍照，应用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析。
2.6 qRT-PCR检测CXCL12/CXCR4信号轴及TXNIP/NLRP3炎症小体通路相关基因表达
按照试剂盒说明书提取各组大鼠肝组织中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表1。
2.7 Western blotting检测CXCL12/CXCR4信号轴及TXNIP/NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达
取各组大鼠肝组织，加入裂解液匀浆后提取蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，100 ℃加热使蛋白变性。蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于甲醛中浸泡2 min后，用膜转移液清洗1次，加入5% 牛血清白蛋白溶液，37 ℃封闭0.5 h，分别加入β-actin、α-SMA，Collagen Ⅰ、CXCR4、CXCL12、NLRP3、TXNIP、ASC、Caspase-1、IL-1β抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜，用PBST洗涤3次，加入二抗（1∶5000），孵育2 h，PBST清洗3次，加入ECL溶液完全覆盖PVDF膜，室温孵育3 min，使用凝胶成像仪成像，以Quantity One软件定量分析。
2.8 统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行数据的统计分析，对于符合正态分布、具有方差齐性的数据采用单因素方差分析；对于符合正态分布的数据，不具有方差齐性的数据，采用独立样本T检验；对于不服从正态分布的数据，则选择非参数检验中Mann-Whitney U方法进行检验。
3 结果
3.1 AS-IV减轻肝纤维化大鼠肝脏损伤及纤维化
如图1-A所示，与空白组比较，模型组大鼠血清中ALT和AST活性均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组ALT和AST活性均显著降低（P＜0.01）。血清肝纤维化标志物结果见图1-B，与空白组比较，模型组大鼠血清中HA水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，40 mg/kg AS-Ⅳ可显著降低HA水平（P＜0.05），LN、PCⅣ、PⅢP在各组间无统计学差异。
如图1-C所示，模型组肝组织HE染色可见大量肝细胞坏死，细胞肿胀，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润（蓝色箭头），多见肝细胞脂肪变性（黑色箭头），汇管区胆管增生；Masson染色显示组织中汇管区门静脉与中央静脉周围均可见大量胶原纤维增生（红色箭头），并形成大量纤维横隔，可见大量假小叶。40 mg/kg AS-Ⅳ组局部见肝细胞脂肪变性（黑色箭头）及淋巴细胞浸润（蓝色箭头）；局部可见胶原纤维增生（红色箭头）及纤维横隔。20 mg/kg AS-Ⅳ组HE染色多见肝细胞脂肪变性（黑色箭头）、局部肝小叶中与汇管区周围可见肝细胞坏死溶解；Masson染色显示组织中汇管区门静脉与中央静脉周围可见较多胶原纤维增生（红色箭头），并形成纤维横隔。各组炎症活动度及纤维化程度评分见图1-D，Mann-Whitney U检验显示，与空白组比较，模型组炎症活动度评分、纤维化程度评分均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组炎症活动度评分均显著降低（P＜0.01），40 mg/kg AS-Ⅳ组纤维化程度评分显著降低（P＜0.05），20 mg/kg AS-Ⅳ组纤维化程度无统计学差异。
3.2 AS-Ⅳ抑制肝纤维化大鼠HSCs活化
为探明AS-Ⅳ对肝纤维化大鼠HSCs活化的抑制作用，通过免疫组化、qRT-PCR、Western blotting法检测HSCs活化的重要指标α-SMA和Collagen Ⅰ的表达。qRT-PCR（图2-A）显示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织α-SMA和Collagen Ⅰ mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组α-SMA和Collagen Ⅰ mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）。Western blotting（图2-B、C）显示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。免疫组化结果见图2-D、E，棕色的部分为蛋白的阳性表达，与空白组比较，模型组大鼠肝组织α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白阳性表达均显著增强（P＜0.01）；与模型组比较，40 mg/kg AS-Ⅳ可显著降低α-SMA和Collagen Ⅰ的表达（P＜0.05、0.01），其结果与Western blotting基本一致。
3.3 AS-Ⅳ下调肝纤维化大鼠肝组织CXCL12/CXCR4信号轴蛋白表达
如图3-A所示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织CXCL12和CXCR4 mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，40 mg/kg AS-Ⅳ能在一定程度上抑制CXCL12 mRNA表达，显著抑制CXCR4 mRNA表达（P＜0.01）。Western blotting结果见图3-B、C，与空白组比较，模型组CXCL12和CXCR4蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组CXCL12和CXCR4蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。
3.4AS-Ⅳ下调肝纤维化大鼠肝组织TXNIP/NLRP3炎性体路径中关键因子的表达
如图4-A所示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织中TXNIP、NLRP3、ASCmRNA表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，40 mg/kg AS-Ⅳ能显著抑制TXNIP、NLRP3、ASCmRNA表达（P＜0.05、0.01）。如图4-B所示，与空白组比较，模型组TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，40 mg/kg AS-Ⅳ组TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表达显著降低（P＜0.05），20 mg/kg AS-Ⅳ组ASC、IL-1β蛋白表达显著降低（P＜0.05、0.01）。
4 讨论
HSCs活化是肝纤维化进程中的主要驱动力，抑制HSCs活化是抗肝纤维化药物研究的重要靶标[17]。病毒、酒精、寄生虫等多种病因导致急慢性肝损伤，可直接或间接诱导HSCs活化，活化的HSCs向肌成纤维细胞转化，明显高表达α-SMA[18]。α-SMA的表达情况不仅能反映HSCs的活化程度，还能在一定程度上判断病情及预后[19]。此外，活化的HSCs可分泌Collagen Ⅰ，研究发现阻断Collagen I前胶的输出可促进HSC的凋亡[20]。本研究发现，经CCl4及乙醇刺激后，模型组大鼠肝组织α-SMA、Collagen I蛋白及mRNA表达水平均显著升高，提示模型组存在活跃的HSCs活化，AS-Ⅳ治疗后显著下调了α-SMA及Collagen I的表达，说明AS-Ⅳ可抑制肝纤维化大鼠HSCs活化，这与既往的研究结果一致[21]。
CXCL12又被称为基质细胞衍生因子-1，在肝脏中主要在HSCs、肝窦内皮细胞等表达，可随着急、慢性的肝损伤而增高[22]。CXCR4是CXCL12的特异性受体，研究发现，CXCL12/CXCR4轴可通过募集免疫细胞促进肝脏炎症及纤维化[23]，其高表达会诱导HSCs活化增殖[24]，而抑制CXCL12/CXCR4轴可促进肝纤维化过程中肝血管重塑、抑制HSCs增殖和迁移[25-26]。本研究发现AS-Ⅳ可显著降低肝组织CXCL12、CXCR4的mRNA及蛋白表达，说明AS-Ⅳ抗肝纤维化、抑制HSCs活化的作用可能与抑制CXCL12/CXCR4轴有关。
TXNIP是一种炎症的内源性调节因子，可在危险信号刺激下与NLRP3形成TXNIP/NLRP3复合物，激活NLRP3炎性体[27]。研究发现敲除小鼠TXNIP基因，可显著减少NLRP3炎性体激活[28]。NLRP3炎性体是一种由NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）家族构成的多蛋白复合物，NLRP3通过招募ASC和pro Caspase-1完成炎性体的装配，介导Caspase-1激活，释放IL-1β[29]。NLRP3炎性体活化是肝脏疾病过程中的肝细胞损伤、炎症放大的重要原因[30]。研究发现，HSCs中NLRP3炎性体激活，分泌IL-1β可直接活化HSCs，并可通过旁分泌的方式促进周围HSCs活化，从而促进肝纤维化[31]。而抑制NLRP3炎性体活化可改善肝纤维化[32]。本研究发现，40 mg/kg AS-Ⅳ可显著降低TXNIP、NLRP3、ASC、IL-1β的表达，提示AS-Ⅳ可能参与调节TXNIP/NLRP3炎性体路径。
本研究发现AS-Ⅳ可显著减轻CCl4联合乙醇诱导的大鼠肝细胞损伤及纤维化，并能显著抑制HSCs活化，其机制可能与抑制CXCL12/CXCR4轴和TXNIP/NLRP3炎性体路径有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：苏 悦，宋虹霏，王 鑫，刘 进，肖 萍，许欣怡，彭杨芷．黄芪甲苷经CXCL12/CXCR4信号轴及TXNIP/NLRP3炎性体路径抗肝纤维化的机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(8):2453-2462.
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
