导读
本研究旨在分析蒲公英（T. officinale）衍生的外泌体样纳米囊泡（ELNs）是否在间歇性缺氧（IH）诱导的高血压疾病中发挥降压作用及其潜在机制。在这项研究中，我们开发了蒲公英衍生的天然纳米颗粒，具有理想的尺寸和稳定的负表面电荷，含有大量脂质和一些功能蛋白。我们发现，在IH诱导的高血压大鼠模型中，ELNs有效地降低了IH诱发的高血压，对肠组织表现出局部抗炎作用，并减少了肠组织损伤，包括杯状细胞的损失和屏障完整性损伤，最终抑制了全身炎症反应。此外，我们评估了肠道微生物组成和短链脂肪酸含量，发现肠道微生物的结构和多样性发生了显著变化，丁酸盐被确定为菌群整体差异的最重要原因。因此，我们进一步评估了丁酸盐是否为ELNs在IH诱导的高血压疾病中发挥作用的关键靶点。我们发现，丁酸盐干预通过改善IH大鼠的肠道微环境，进一步抑制全身炎症反应和血管壁重塑，从而减轻IH诱导的高血压。蒲公英衍生的ELNs对IH诱导的高血压疾病有效，而丁酸盐在介导ELNs在抗IH诱导高血压疾病中的作用中发挥了主要作用。
论文ID
原名：Taraxacum officinale-derived exosome-like nanovesicles modulate gut metabolites to prevent intermittent hypoxia-induced hypertension
译名：蒲公英衍生的外泌体样纳米囊泡调节肠道代谢产物以预防间歇性缺氧诱导的高血压
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
IF：7.419
发表时间：2023.03
通讯作者：胡克
通讯作者单位：武汉大学人民医院
实验设计
实验结果
1. 蒲公英衍生的ELNs的物理化学性质
为了研究蒲公英衍生的ELNs是否对大鼠阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）诱导的高血压有效，我们首先通过超速离心提取和纯化了ELNs，并对蒲公英衍生的ELNs进行了表征。如图1A所示，我们使用透射电子显微镜（TEM）来表征ELNs，分离出具有完整膜的盘状或球形囊泡状颗粒，其具有典型的外泌体样外观。ELNs含有6.1×107个颗粒/mL，其蛋白质浓度为325.7143 ug/mL。粒度分析显示，平均纳米颗粒尺寸约为142.5 nm，如图1B所示，其Zeta电位为−41.83 mV（图1C）。
蒲公英衍生ELNs的总脂质组成略有不同（图1D）。脂质含量分析显示，主要脂质成分为甘油三酯（TAG，占总脂质的17%）、二酰基甘油三甲基高丝氨酸（DGTS，占总油脂的13%）和磷脂酰乙醇胺（PE，占总脂的9%）。先前的研究表明，脂肪细胞释放的携带TAG颗粒被巨噬细胞摄入并迅速降解以释放脂肪酸，脂肪酸在免疫功能和代谢中发挥着重要作用。众所周知，DGTS可以增加高密度脂蛋白的质量和抗动脉粥样硬化功能；PE与心血管疾病显著相关。
如图1E所示，基因本体论（GO）富集分析显示，ELNs被注释为参与多种生物过程、分子功能和细胞成分。值得注意的是，ELNs诱导了多种氧化酶活性和代谢过程的富集，例如，有60个蛋白显示出氧化还原酶活性，有55个蛋白参与羧酸代谢过程和酮酸代谢过程，有56个蛋白富含细胞酰胺代谢过程。京都基因和基因组百科全书（KEGG）注释途径分析（图1F）显示，ELNs中所含的蛋白质在代谢、光合作用和氧化磷酸化等过程中富集。已知这些蛋白质中的许多在免疫反应中发挥潜在作用，进一步表明了它们在植物免疫中的作用。
图1 蒲公英衍生ELN的物理化学特征
（A）TEM图像，（B）尺寸分布，（C）Zeta电位，（D）蒲公英的脂质图谱，（E）GO分类图，（F）KEGG气泡图。
2. 蒲公英衍生的ELNs预防IH诱导的高血压
接下来，我们试图研究蒲公英衍生的ELN对OSA诱导的高血压的影响。间歇性缺氧模型被广泛用作OSA的模型。因此，我们使用IH处理的大鼠来研究ELNs对高血压的影响。6-8周龄雄性SD大鼠暴露于IH（8小时/天）4周。在IH+ELN组中，在4周的IH处理期间，我们每隔一天通过灌胃给予大鼠一次蛋白质浓度为0.5mg/kg的蒲公英衍生的ELNs。如图2A所示，与假手术组（Sham）相比，IH组大鼠的收缩压在IH 4周后显著增加约77 mmHg。然而，口服蒲公英衍生的ELNs有效地降低了IH诱导的高血压。
图2 ELNs干预对IH引起的高血压和盲肠组织损伤的影响
6-8周龄雄性SD大鼠暴露于IH（8小时/天）4周。对于Sham组，流入的气体始终是室内空气，具有与IH暴露相同的噪音和气流干扰水平。对于Sham+ELN组，每隔一天通过灌胃给予大鼠一次蛋白质浓度为0.5mg/kg的蒲公英衍生ELN，持续4周。对于IH+ELN组，在4周的IH治疗期间，每隔一天通过灌胃给大鼠给予一次蛋白质浓度为0.5mg/kg的蒲公英衍生的ELN。（A）ELNs干预降低了IH诱导的大鼠高血压。（B）HE染色显示肠道病理变化，（C）PAS染色显示肠上皮杯状细胞，（D）杯状细胞计数，以及（E）免疫荧光分析显示细菌（EUB338 FISH探针，红光）和紧密连接蛋白Occludin（绿光）。对于Sham和Sham+ELN，n＝3/组。对于IH和IH+ELN，n＝4/组。与Sham组相比，*p＜0.05；与IH组比较，#p<0.05。
3. 蒲公英衍生ELNs改善肠壁损伤
接下来，我们研究了蒲公英衍生的ELNs对IH诱导的肠壁变化的影响。如图2B所示，H&E染色结果表明，与假手术组相比，IH组的肠道组织损伤、粘膜下水肿、结缔组织增生和炎症细胞局灶性浸润更为明显。ELNs的干预在组织水平上减轻了肠道损伤，减少了炎症细胞的浸润，尤其是淋巴细胞。先前的研究已经证明了盲肠粘液层的生理相关性和保护功能，其缺失会导致肠道炎症和细菌与肠上皮的直接接触。如图2C, D所示，与假手术组相比，IH显著减少盲肠中可产生粘液的杯状细胞数量，而用口服ELNs减弱了这种表型。
图3 ELNs可减弱IH诱导的炎症反应
（A）免疫荧光检测盲肠组织中IL-1β（红光）、IL-6（绿光）和TNF-α（红光）的表达，（B）ELISA法检测血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。对于Sham和Sham+ELN，n＝3/组。对于IH和IH+ELN，n＝4/组。与Sham组相比，*p＜0.05；与IH组比较，#p<0.05。
4. 蒲公英衍生ELNs减少肠道屏障损伤
紧密连接蛋白的完整性受损是增加肠上皮细胞通透性的关键因素。因此，我们接下来检查了盲肠细菌的数量和紧密连接蛋白Occludin的表达，使用EUB 338 FISH探针对细菌进行无偏标记，结果证实（图2E）与假手术组相比，IH组的肠道细菌数量显著增加，然而，Occludin的表达显著降低。用ELNs处理后，细菌数量显著减少，Occludin的表达显著增加。上述结果表明，IH诱导后大鼠肠道细菌数量显著增加，肠道屏障受损，这增加了细菌与上皮细胞直接接触的可能性，但通过用蒲公英衍生的ELNs处理可以缓解这种情况。
图4 不同组大鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）的分析。在实施安乐死之前，收集不同组大鼠的粪便
（A）显示SFCA丰度的热图，（B）主成分分析图，（C）因子载荷图，（D）七个SFCAs的配对比较测试图。n=4/组。与Sham组相比，*p＜0.05；与IH组比较，#p<0.05。
5. 蒲公英衍生的ELNs改善IH诱导的炎症反应
越来越多的研究表明，慢性炎症与多种心血管疾病有关，因此，炎性细胞因子已成为治疗心血管疾病的重要靶点。为了评估ELNs对IH诱导的局部肠道和全身炎症反应的影响，我们进行了免疫荧光和ELISA测定。如图3A所示，我们检测到IH大鼠肠道组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌显著增加，而这些炎性细胞因子的水平在ELNs治疗后显著降低。如图3B所示，全身炎症反应标志物的结果与肠道局部组织的结果高度一致，这表明ELNs具有强大的抗炎作用。
图5 肠道微生物多样性及相关分析
在实施安乐死之前，从大鼠身上采集粪便。（A）属水平物种分布覆盖（B）微生物α多样性与ACE指数和Shannon指数进行比较，（C）PcoA使用Bray分析方法计算3组之间的距离。（D）LefSe分析用于区分3组之间不同的微生物组，（E）Platts分析，（F）相关性分析。n=4/组。与Sham组相比，*p＜0.05；与IH组相比，#p＜0.05。
6. 各组大鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）的比较分析
先前的研究表明，SCFAs与各种高血压模型密切相关，因此，在本研究中，我们测量了不同实验组大鼠粪便中SCFAs的含量。如图4A所示，我们发现不同实验组大鼠粪便中SCFAs的含量存在显著差异，假手术组大鼠排泄物中丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和异丁酸的含量较高。虽然在IH+ELN组中乙酸和己酸的量较高，但值得注意的是，上述七种SCFAs的含量在IH组中显著降低。通过主成分分析（图4B），我们发现假手术组的样本主要位于X轴的正方向，IH组的样本均位于X轴负方向，IH+ELN组的样本则主要位于X轴线原点附近，这表明三组样品中SCFA的整体结构存在明显差异。如因子载荷图所示（图4C），丁酸是载荷最大的SCFAs，这进一步表明丁酸可能是三组SCFAs之间整体结构差异的主要原因之一。在分析短链脂肪酸整体结构的基础上，我们分析了七组短链脂肪酸酯之间的差异（图4D），发现IH组大鼠粪便中戊酸、丙酸、丁酸、己酸、异丁酸和异戊酸的含量显著低于Sham组。然而，IH组的丁酸、己酸、异丁酸和异戊酸的含量显著低于IH+ELN组。不同组大鼠粪便中的短链脂肪酸存在明显差异，我们推测丁酸可能是造成总体差异的主要原因。
图6 丁酸盐干预对IH引起的高血压和盲肠组织损伤的影响
6–8周龄雄性SD大鼠在4周的IH期间每天灌胃一次浓度为100 mg/kg的丁酸盐，对照组用相同体积的PBS处理。（A）丁酸盐干预降低了IH引起的高血压，（B）HE染色显示肠道病理变化，（C）PAS染色显示肠上皮杯状细胞，（D）杯状细胞计数，（E）显示细菌的免疫荧光（EUB338 FISH探针，红光）和屏障连接蛋白Occludin（绿光）。n=4/组。与IH组比较，#p<0.05。
7. 各组大鼠肠道微生物多样性分析
越来越多的研究表明，肠道微生物参与短链脂肪酸的代谢途径，宿主肠道微生物组组成与健康状况之间存在明显关系。本研究分析了大鼠粪便中细菌的多样性（图5A），发现大鼠肠道中的优势菌属主要为乳杆菌属、真细菌属、Lachnospiraceae_NK4A136和Romboutsia等，上述优势菌属的相对丰度在三组之间存在显著差异。如图5B所示，alpha多样性指数通常用于评估样本中微生物的多样性和丰富度。IH组大鼠粪便中微生物的ACE指数显著低于假手术组和IH+ELN组。然而，三组之间的Shannon指数没有显著差异，这表明不同组大鼠粪便中微生物的丰度存在显著差异。同时，主坐标（PcoA）分析（图5C）显示，来自三组大鼠的粪便样本在空间分布上有明显的分离趋势，这表明三组大鼠的肠道微生物结构存在显著差异。如图5D所示，LefSe（线性判别分析效应大小）分析鉴定出了13个差异细菌属，它们可能是导致大鼠肠道微生物组结构出现差异的主要关键菌属。
图7 丁酸盐可减弱IH诱导的大鼠炎症反应
（A）基于免疫荧光检测盲肠组织中IL-1β（红光）、IL-6（绿光）和TNF-α（粉红色光）的表达，（B）ELISA法检测血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。n=4/组。与IH组比较有显著性差异，#p<0.05。
8. SCFAs与肠道微生物组的相关性分析
为了进一步验证SCFAs与微生物组成之间的关系，我们用Platts分析法探讨了大鼠粪便中七种SCFAs和不同细菌属的相似性（图5E）。我们发现两者的空间排列具有显著的一致性，这进一步证实了粪便微生物对短链脂肪酸的影响。如图5F所示，我们通过相关性分析进一步探讨了差异细菌和短链脂肪酸之间的关系，由于丁酸被认为是肠道中的主要短链脂肪酸酯之一，我们假设它是导致菌群差异的潜在候选者。我们重点研究了丁酸盐与差异细菌的相关性，发现Oscillibacter、Ruminiclostridium_5、Ruminiclostridium_9和Rothia与丁酸呈显著正相关，Turicibacter、Clostridium_sensustricto_1和拟普雷沃氏菌与丁酸水平呈显著负相关。这些结果进一步表明，肠道微生物对丁酸盐代谢有重要影响。
9. 丁酸盐可预防IH引起的高血压和肠组织损伤
上述实验结果表明，IH与粪便丁酸盐浓度的降低密切相关，在此基础上，我们在4周的IH期间每天给6-8周龄的雄性SD大鼠灌胃一次浓度为100 mg/kg的丁酸盐，对照组用相同体积的PBS处理。如图6A所示，与PBS处理的IH大鼠相比，丁酸盐干预显著降低了IH诱导的高血压。
接下来，我们研究了丁酸盐对IH诱导的肠道组织损伤的影响。结果显示，与IH组相比，丁酸盐干预后大鼠的肠道组织损伤和炎症细胞浸润显著减少（图6B），而杯状细胞的数量显著增加（图6C和D）。标志着肠道屏障完整性的Occludin的表达水平显著增加，肠道中EUB338标记的细菌数量显著减少（图6E）。上述结果表明，丁酸盐干预后大鼠肠道上皮细胞与细菌直接接触的可能性大大降低。
图8 丁酸盐可减轻IH诱导的大鼠血管壁重塑
（A）胸主动脉的HE染色（×40），（B）胸主动脉的HE染色（×400），（C）中膜厚度（MT）/内腔直径（LD）（%）。Sham为n=3/组，IH和IH+丁酸为n=4/组。与Sham组相比，*p＜0.05，与IH组相比，#p＜0.05。
10. 丁酸盐干预可改善IH诱导的炎症反应
如图7A所示，与PBS处理的IH大鼠相比，丁酸盐干预显著抑制了IH诱导的肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达的升高。同时，我们进一步检测了血浆中炎性细胞因子的水平，如图7B所示，结果与肠组织的免疫荧光染色高度一致，这表明丁酸盐干预通过减少肠道组织损伤和屏障完整性进一步减少全身炎症反应，从而在IH大鼠中发挥抗高血压作用。
11. 丁酸盐干预改善IH诱导的血管壁重塑
如图8所示，与PBS处理的IH大鼠相比，丁酸盐干预显著降低了大鼠胸主动脉的MT/LD。这表明丁酸盐干预可能通过降低IH大鼠血管壁重塑的程度而发挥抗高血压作用。
讨论
本研究利用了ELNs的天然递送机制，并证明了其在改善IH诱导的高血压方面的应用前景。目前，基于纳米疗法治疗IH诱导的高血压的报道很少。我们的研究结果表明，在IH诱导的高血压大鼠模型中，蒲公英衍生的ELN有效地降低了IH诱发的高血压，对肠道组织表现出局部抗炎作用，并减少了肠道组织损伤，包括杯状细胞的损失和屏障完整性损伤，最终抑制了全身炎症反应。我们研究了肠道微生物组成和短链脂肪酸含量的变化，发现肠道微生物的结构和多样性发生了显著变化，并确定丁酸盐是导致肠道菌群整体差异的潜在原因。因此，我们随后用丁酸盐干预了IH大鼠，发现它改善了IH小鼠的肠道微环境，并进一步抑制了全身炎症反应和血管壁重塑，以减轻IH诱导的高血压。
植物细胞中含有生物活性脂质和蛋白质的ELNs作为细胞外信使，调节受体细胞中的基因表达，并在受体细胞的“物种间沟通”和各种分子途径的调节中发挥重要作用。在本研究中，我们从可食用植物蒲公英中分离并表征了具有典型形态的ELNs，其平均纳米颗粒尺寸约为142.5 nm，ζ电位为−41.83 mV，表明它们具有理想的尺寸和稳定的表面电荷。对蒲公英衍生ELNs的脂质组学分析表明，它主要由TAG、DGTS和PE组成，所有这些主要成分都与心血管疾病密切相关。我们进一步对ELNs进行了蛋白质组学分析，发现其中许多蛋白质在调节免疫反应中发挥了潜在作用，这表明ELNs可能参与植物免疫和抵御病原体入侵的防御反应。
几乎所有的实验都证实IH促进了肠道屏障功能的破坏并激活了炎症反应。药用植物来源的ELN已被证明能有效抑制哺乳动物的炎症反应和肠道屏障损伤。我们研究了ELNs对IH引起的肠道组织损伤和高血压的影响。几项基于人群的研究表明，阻塞性睡眠呼吸暂停在男性中比在女性中更常见。此外，一些研究表明，雌激素可能对OSA引起的心肺功能障碍具有保护作用。为了消除雌激素的干扰，我们选择使用雄性大鼠进行本研究。我们发现IH大鼠有严重的肠道组织损伤，伴有显著的炎症细胞浸润，肠道细菌数量和炎症反应显著增加。同时，这些大鼠肠道中分泌粘液的杯状细胞数量和紧密连接蛋白Occludin的表达水平显著降低。然而，在用蒲公英衍生的ELN处理后，这些参数发生了逆转。我们还发现，ELNs显著降低了IH大鼠的收缩压（SBP）和全身炎症反应，这可能是由于蒲公英衍生的ELNs通过改善肠道微环境和进一步抑制全身炎症反应来降低IH大鼠的高血压。ELNs对IH诱导的雌性大鼠高血压是否具有同样的保护作用值得进一步研究。
人类肠道微生物数量巨大，通过复杂的代谢因子（如短链脂肪酸）影响宿主的病理生理功能，短链脂肪酸在被肠粘膜细胞吸收到血液中后发挥着重要的生物学作用。因此，我们检测了大鼠粪便中SCFAs的含量，发现不同组大鼠的粪便中SCFAs的含量存在显著差异，其中IH组大鼠所有7种SCFAs的浓度均显著低于其他两组，因子载荷图显示，丁酸盐可能是导致三组SCFAs总含量差异的最重要因素。接下来，我们通过16S rRNA基因测序研究了肠道微生物群的组成和多样性，结果表明，不同实验组大鼠粪便中微生物的组成和多样化存在显著差异。LEFSe分析共鉴定出13个不同的细菌属，这可能是导致大鼠肠道微生物群结构差异的主要因素。此外，我们通过Platts分析发现，大鼠粪便中七种SCFAs和差异富集菌属的空间排列具有显著的一致性，这证实了粪便微生物参与SCFAs的代谢。由于丁酸可能是导致菌群整体差异的主要原因，我们最终探索了差异细菌与丁酸盐之间的相关性。我们的研究结果表明，Ruminiclostridium和Oscillibacter这两种促进丁酸产生的菌，在用蒲公英衍生的ELNs处理后，相对丰度显著增加。这与之前发表的一项研究结果高度一致。另一方面，Turicibacter和Clostridium_sensus_stricto_1与丁酸盐水平呈显著负相关，据报道，降低这两种细菌的相对丰度在大多数疾病的治疗中起着重要作用。
丁酸盐不仅具有抗炎和抗高血压作用，而且对肠道黏膜也有积极作用，肠道黏膜是肠道的防御屏障。因此，为了研究丁酸盐是否是ELNs减轻IH诱导的大鼠高血压的主要原因，我们在IH期间每天给大鼠灌胃一次100mg/kg的丁酸盐，而对照大鼠被给予相同体积的PBS。我们的研究结果表明，口服丁酸盐可显著减少肠道组织损伤、局部炎症反应和肠道细菌数量，并显著增加与肠道屏障完整性相关的紧密连接蛋白Occludin的表达，并显著提高杯状细胞的数量。这些结果表明，丁酸盐在维持机体免疫炎症稳态和肠道屏障功能方面发挥着重要作用。同时，丁酸盐干预显著降低了IH诱导的高血压，我们的实验还表明，在肠道微环境改变后，丁酸盐处理的IH大鼠全身炎症反应和血管壁重塑也被显著抑制。尽管己酸、异丁酸和异戊酸在肠道短链脂肪酸中所占比例很小，但它们与高脂血症和动脉粥样硬化等疾病密切相关。因此，它们对IH诱导的高血压是否具有与丁酸相同的保护作用，或者它们是否与丁酸具有协同保护作用，值得进一步研究。
结论
在本研究中，我们证明了蒲公英衍生的ELNs能够有效降低IH诱导的高血压，主要是通过增加丁酸的产生，丁酸是肠道微生物的代谢产物。ELNs介导的丁酸水平的增加对肠道组织损伤、局部炎症反应和屏障完整性破坏具有保护作用，并最终抑制全身炎症反应和血管壁重塑。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332223003608
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