导读
背景：二仙汤是一种可以预防和控制骨关节炎（OA）和骨质疏松症（OP）病程的中草药复方。OP和OA是两种与年龄相关的疾病，通常在老年人中共存，并且都与肠道微生物组失调有关。我们先通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和网络药理学筛选技术获得黄藤素（palmatine，PAL），随后通过16S rRNA测序和肠内容物血清代谢组学，来探讨PAL治疗OA和OP的作用机制。
方法：我们将为本研究选择的大鼠随机分为三组：假手术组、OA-OP组和PAL组。假手术组给予生理盐水灌胃，PAL组给予PAL治疗56天。通过显微计算机断层扫描（micro-CT）、ELISA、16S rRNA 基因测序和非靶向代谢组学研究，我们探讨了肠道菌群和血清代谢物在PAL治疗OA-OP大鼠中的潜在机制。
结果：黄藤素显着修复OA-OP大鼠股骨骨微结构，改善软骨损伤。肠道菌群分析表明，PAL还可改善OA-OP大鼠肠道菌群紊乱。例如，厚壁菌门、拟杆菌门、 放线菌门、乳杆菌属、unclassified_f_毛螺菌科、norank_f_穆氏杆菌科、乳杆菌科、毛螺菌科和穆氏杆菌科的丰度在PAL干预后增加。此外，代谢组学数据分析结果表明，PAL也改变了OA-OP大鼠的代谢状态。PAL干预后，5-甲氧基色氨酸、2-甲氧基对乙酰氨基酚硫酸盐、β-酪氨酸、吲哚-3-羧酸-O-硫酸盐和cyclodopa glucoside等代谢物增加。代谢组学和肠道微生物群 (GM) 的关联分析表明，多种菌群和不同代谢物的通讯在OP和OA 中起着重要作用。
结论：黄藤素可以改善OA-OP大鼠的软骨退变和骨丢失。我们提供的证据支持PAL通过改变GM和血清代谢物来改善OA-OP的观点。此外，GM和血清代谢组学相关性分析的应用为揭示草药治疗骨病的机制提供了新的策略。
论文ID
原名：The mechanism of palmatine-mediated intestinal flora and host metabolism intervention in OA-OP comorbidity rats
译名：黄藤素介导的OA-OP合并症大鼠肠道菌群及宿主代谢干预机制
期刊：Frontiers in Medicine
IF：5.058
发表时间：2023.04
通讯作者：王培民
通讯作者单位：南京中医药大学附属医院
实验设计
实验结果
1. 药物活性成分筛选
根据筛选条件，我们从二仙汤（EXD）中获得了317种有效成分。在删除无效和重复的目标后，有294种活性成分被纳入该分析。根据前期的研究，我们通过HPLC分析得到了452个单体成分。我们将网络药理学筛选结果与HPLC鉴定结果作图，得到17个常见成分，如表1和图1A所示。
表1 共有17种常见活性成分
图1 网络药理学分析。(A)共同目标获取。(B)药物-疾病目标网络建设。蓝色圆圈代表共同基因，绿色圆圈代表EXD的活性成分。(C) PPI网络图。
基于17个共同成分和GeneCard、DisGeNET、OMIM、DrugBank和PharmGKB数据库，我们筛选出447个药物靶点。我们使用Cytoscape软件构建了药物活性成分共同靶点的网络图，包括464个点和1677条边（图1B、C）。以度值作为拓扑分析的主要参考，活性成分前五位分别为棕榈碱、腺嘌呤、香草醛、山柰酚和异芒果苷，这些前面的药物成分可能是EXD治疗OA和OP的关键化合物。根据拓扑分析结果和之前的研究（补充表1），我们选择PAL进行后续实验。流程图（补充文件1）中说明了如何识别黄藤素的详细过程。
2. 黄藤素改善大鼠骨骼结构
显微CT已成为评估OP动物模型骨微结构的关键工具。我们用显微CT扫描每组的个别股骨样本，并在三个维度上重建关注的区域（图2）。结果显示，与假手术组相比，OA-OP组骨小梁减少、断裂，骨小梁间距变宽，说明OA-OP组骨微结构被破坏，骨丢失并发生了骨质疏松症。但PAL干预后，我们观察到骨小梁数量增加，骨小梁间距减小，骨小梁厚度增加，骨强度部分恢复，阻止了骨丢失的过程。此外，与假手术组相比，股骨小梁数（Tb. N）、骨小梁体积分数（BV/TV）、骨表面积密度（BS/TV）和小梁厚度（Tb. Th）和结构模型指数（SMI）显着降低 (p < 0.05)，而骨小梁模式因子（Tb. Pf）、小梁间隙（Tb. Sp）和SMI显着增加 (p < 0.05)。Tb. Pf和SMI可以衡量杆状和板状骨小梁的程度，它们的增加表明骨小梁由板状向杆状转变。结合骨量和骨小梁厚度及数量的减少，我们成功建立了大鼠去卵巢术（OVX）模型。与OA-OP组相比，PAL组股骨Tb. N、BV/TV、BS/TV、Tb. Th明显升高(p < 0.05)，Tb. Pf和SMI显着降低 (p < 0.05)。
图2 PAL对OA-OP大鼠骨小梁形态参数的影响。PAL给药后56天股骨远端和胫骨近端的显微CT图像；Tb. N、BV/TV、BS/TV、Tb. Th，Tb. Pf、Tb. Sp和SMI，PAL给药后56天显微CT分析。*统计学差异显着 (P < 0.05)。**统计学上的显着差异(P < 0.01)。
3．黄藤素对大鼠骨代谢的影响
结果显示（图3），与假手术组相比，OA-OP组血清雌二醇（E2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨胶蛋白（BGP）和1,25-二羟基维生素（D31,25(OH)2D3）含量降低，而钙（Ca）含量升高（p < 0.05）。PAL组OA-OP大鼠血清中 E2、ALP、BGP和1,25(OH)2D3水平升高 (p < 0.05)。
图3 PAL对OA-OP大鼠骨代谢的影响。血清 E2、ALP、BGP、1,25(OH)2D3、Ca和磷（P）水平的定量分析。*差异有统计学意义 (P < 0.05)。**统计学上的显着差异 (P < 0.01)。***具有统计学意义的差异 (P < 0.001)。
4. 黄藤素改善了大鼠的OA和OP过程
与OA-OP组相比，假手术组软骨表面光滑，PAL组软骨破坏较少。OARSI评分与固绿染色一致，OA-OP组评分显着高于假手术组，PAL组OARSI评分低于OA-OP组。与假手术组相比，OA-OP组股骨H&E染色显示PAL可改善OA-OP对关节外基质的破坏。TRAP染色假手术组阳性细胞数少于OA-OP组,PAL染色减少OA-OP组阳性细胞数。WB结果（图4）显示OA-OP组软骨中基质金属蛋白酶3（MMP3）和基质金属蛋白酶13（MMP13）蛋白表达水平升高（p < 0.05），而PAL可以降低膝关节骨性关节炎（KOA）组软骨中MMP3和MMP13的蛋白表达水平 (p < 0.05)。在OA-OP组中，Runt相关转录因子2（Runx-2）和骨桥蛋白（OPN）的蛋白表达水平降低 (p < 0.05)，而PAL可以增加KOA软骨中RUNX-2和OPN的蛋白表达水平 (p < 0.05)。
图4 PAL对OA-OP大鼠骨病理切片的影响。(A) 用H & E、Saffron O/Fast Green和TRAP染色的大鼠膝关节组织切片的代表性
。(B)大鼠组织中蛋白条带的代表性图像。(C)大鼠软骨中蛋白条带的代表性图像。(D) MMP3在软骨中的相对表达水平。(E) MMP13在软骨中的相对表达水平。(F) 股骨中OPN的相对表达水平。(G) RUNX-2在股骨中的相对表达水平。*统计学差异显着 (P < 0.05)。**统计学上的显着差异 (P < 0.01)。***具有统计学意义的差异 (P < 0.001)。
5. PAL对OA-OP大鼠肠道菌群组成的影响
为进一步研究PAL对肠道菌群的影响，我们采用16S RNA测序分析了3组18份样本的粪便菌群。对于α-多样性，我们发现三组之间的ACE、Chao1和Shannon指数存在显着差异（图5A），表明PAL处理可能对OA-OP大鼠的肠道菌群产生显着影响。我们使用PCoA方法分析了β多样性。如图5B所示，PCoA显示各组微生物群组成显着聚集，并显示OA-OP组大鼠的微生物群落与假手术组和PAL组有显着差异，表明PAL治疗可以通过调节GM失衡来改善大鼠的OA和OP。接下来，为了评估GM的具体变化，我们进一步分析了优势群体的相对丰度（图 5C）。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占优势。在属水平上，乳杆菌、unclassified_f_毛螺菌科和norank_f_穆氏杆菌科占优势。在科水平上，乳杆菌科、毛螺菌科和穆氏杆菌科占优势。为了进一步探索假手术组、OA-OP组和PAL组之间肠道微生物群的差异，我们使用 LEfSe来识别每个系统发育水平的特定变化的细菌表型。如图5D所示，p < 0.05和LDA > 3.0是筛选秩和检验中显着差异的生物标志物，共27株特异菌分为3组，其中假手术组特异菌5株，OA-OP组19株，PAL组3株。
图5 肠道菌群分析。(A)通过Chao1、ACE和Shannon评估肠道微生物的alpha多样性；(B) pCoA评分图和组间距离箱线图；(C) 门、属、科水平的物种组成丰度图和丰度聚类热图；(D) 从领域到物种的肠道微生物LEfSe和LDA显示这些特定细菌的分数。*统计学差异显着 (P < 0.05)。
6. PAL对OA-OP大鼠宿主代谢的影响
我们通过LC-ESI-MS/MS系统对血液样本进行分析，研究各组宿主的代谢状态。PLS-DA用于评估两组之间血液代谢特征的差异。PAL组与OA-OP组明显分离，表明PAL可以调节模型大鼠的代谢（图 6A，B）。在下一步中，我们基于OPLS-DA在假手术组和OA-OP组之间筛选潜在的生物标志物。此外，PLS-DA模型通过位移试验进行验证，表明拟合良好。在线HMDB、Metlin、MassBank、MzCloud和数据库用于筛选93种潜在生物标志物，包括46种上调代谢物和47种下调代谢物（图6C 补充表2）。我们根据VIP值对前30种代谢物进行了数据聚类分析，以显示代谢物表达的差异（图 6D）。横坐标表示样品名称，纵坐标表示按VIP值排名前30位的差异代谢物。图中，红色代表上调，绿色代表代谢物下调。结果显示，各组间代谢物水平存在显着差异。此外，我们分析了93种不同代谢物的代谢途径，以探索PAL调节的代谢途径。 当p < 0.05时，代谢途径被认为与PAL干预显着相关。这些途径主要涉及酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、泛醌及其他萜类醌生物合成等（图6E和补充表3）。
图6 代谢组学分析。(A) OPLS-DA得分图和OPLS-DA排列检验图(POS)； (B) OPLS-DA得分图和OPLS-DA排列检验图 (NEG)； (C) OA-OP和PAL一维代谢物火山图的比较。阈值设置p < 0.05和| log2fc|≥1（FC，倍数变化）； (D) VIP分析图表。左侧为代谢物簇树，颜色代表该代谢物在该组样本中的相对表达量。右侧是代谢物的VIP条形图。条形长度表示代谢物对两组之间差异的贡献值。值越大，两组之间的差异越大。条形颜色表示两组样品之间代谢物的显着差异。(E)血浆差异代谢物的代谢途径分析。
7. 代谢组学与转基因相关性分析
在Spearman相关分析中，我们分析了丰度排名前20的不同代谢物以及科、属和门菌群，以确定PAL对OA-OP大鼠肠道菌群和代谢关系的影响。数据显示，在科水平，PAL处理改变了脱硫弧菌科、Eggerthellaceae、消化链球菌科、瘤胃球菌科和norank_o_Clostridia_UCG-014的丰度，并影响了4-乙基苯基硫酸盐、LysoPC (20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z))的代谢水平 /0:0)、2-羟基肉桂酸、Henicosanoylcarnitine、1-O-十六烷基-sn-丙三醇-3-磷酸胆碱和去氧胞苷(图 7A)。在属水平上，Romboutsia、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、脱硫弧菌属和Marvinbryantia的丰度变化影响了Henicosanoylcarnitine、2-羟基肉桂酸、1-O-十六烷基-sn-丙三醇-3-磷酸盐、去氧胞苷和4-乙基苯基硫酸盐的水平（图7B)。在门水平上，弯曲杆菌门、蓝细菌门、脱硫杆菌门、厚壁菌门和Patescibacteria的丰度变化影响了1-O-isopentyl-3-O-十八碳-2-烯脂酰甘油、4-乙基苯基硫酸盐、去氧胞苷、对香豆酸、2-羟基肉桂酸、(12Z)-10-羟基十八碳烯酰肉碱、1-O-十六烷基-sn-丙三醇-3-磷酸胆碱和异二十碳酰肉碱的水平(图7C)。
图7 肠道菌群与靶向代谢分析之间相关性分析的热图。 (A)肠道菌群与代谢物在科水平的相关性；(B)肠道菌群与代谢物在属水平上的相关性；(C)肠道菌群和代谢物在门水平上的相关性。*统计学差异显着 (P < 0.05)。** 统计学上的显着差异(P < 0.01)。
讨论
在本研究中，我们首先在前人研究的基础上进行药物单体筛选，然后利用网络药理学进一步细化选择。EXD中的活性化合物是从TCMSP和BATMAN-TCM 数据库中检索和筛选的。这些活性化合物与之前研究的UPLC-QTOF-MS数据相匹配，得到17种常见活性成分。 然后，我们基于GeneCard、DisGeNET、OMIM、DrugBank和PharmGKB数据库搜索并筛选了OA和OP的基因靶点。通过对OA-OP的17种常见活性成分和基因靶点进行拓扑分析，并通过对结果的分析和以往的文献研究，我们最终选择黄藤素进行进一步的实验。有关黄藤素选择过程的更详细描述，请参阅补充文件 1。
网络药理学、代谢和肠道菌群在人体中都是相互关联的。网络药理学与代谢的关系是药物可以与代谢酶相互作用，从而影响其药代动力学和药效学。药物可能被特定的酶代谢，而该酶的遗传变异可能会影响药物的代谢方式，从而导致药物疗效和毒性的差异。代谢与肠道菌群之间的关系是肠道微生物组也会影响药物代谢。一些肠道细菌可以产生代谢药物的酶，从而影响药物的疗效和毒性。 此外，肠道微生物组会影响药物在肠道中的吸收，这也会影响药物的疗效和毒性。
在这项研究中，PAL对OA-OP大鼠肠道菌群和血清代谢物谱的影响通过非靶向LC-MS/MS代谢组学和16S rDNA测序技术确定。结果表明，PAL处理可影响大鼠的血清代谢物谱和肠道菌群。与空白组相比，KOA组代谢物包括5-甲氧基色氨酸、2-甲氧基对乙酰氨基酚硫酸盐、β-酪氨酸、吲哚-3-羧酸-O-硫酸盐和cyclodopa glucoside等代谢物上调；然而，这些代谢物在PAL处理后被回调。这些代谢物参与酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、泛醌等萜类醌的生物合成。肠道菌群方面，厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、乳杆菌、unclassified_f_毛螺菌科、norank_f_穆氏杆菌科、乳杆菌科、毛螺菌科和穆氏杆菌科的丰度与PAL给药后的假手术组相似。结果表明，PAL通过多靶点影响OA-OP大鼠代谢物水平和部分肠道菌群丰度，从而改善OA-OP小鼠的体征。
研究者已发现 5-甲氧基色氨酸 (5-MTX)具有清除自由基和抗氧化活性的潜力。5-甲氨蝶呤还可以协调多种哺乳动物的昼夜节律。此外，5-MTX作为抗氧化剂、免疫调节剂和抗癌剂具有重要的生物学功能。一项研究表明5-MTX可以抑制破骨细胞形成并促进成骨细胞分化。此外，5-MTX可以抑制促炎细胞因子，降低MMP-2和MMP-9的水平，改善大鼠的滑膜炎症。2-甲氧基对乙酰氨基酚硫酸盐是乙酰胺基团的成员。
长期以来，乙酰胺一直被认为与谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸的水平有关。N-乙酰半胱氨酸可以调节多种病理生理过程，包括氧化应激、细胞凋亡、线粒体功能障碍以及谷氨酸和多巴胺神经递质系统失衡。其他研究表明，2-甲氧基对乙酰氨基酚硫酸盐对神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆）具有干预作用。苯丙氨酸是人体必需的芳香族氨基酸之一，由于人体内没有相关的合成途径，只能通过食物从外界获取。苯丙氨酸主要在肝脏中分解代谢，并被苯丙氨酸羟化酶催化形成酪氨酸。酪氨酸是一种在人类和其他哺乳动物中发现的非必需氨基酸。酪氨酸分解代谢由多种代谢酶催化，包括酪氨酸氨基转移酶、4-羟基苯基丙酮酸、4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶、尿黑酸、尿黑酸 1,2-双加氧酶、富马酰乙酰乙酸酶和富马酸。酪氨酸代谢酶的消耗导致代谢物的积累，进一步导致DNA损伤、组织损伤和细胞内谷胱甘肽的消耗，最终导致细胞凋亡。此外，体内酪氨酸的过度积累还会引起TCA循环中几种关键酶，如柠檬酸合酶、苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶等功能发生变化，导致体内能量代谢紊乱，氧化代谢紊乱，线粒体应激。我们的结果表明，PAL可以通过调节酪氨酸和苯丙氨酸代谢来改善OA-OP大鼠的疾病进展。
越来越多的研究表明，肠道稳态失衡可能诱发多种外免疫和代谢疾病（如骨质疏松症、骨关节炎、银屑病和系统性红斑狼疮）。肠道菌群是激活和维持肠道生理功能的关键因素，对维持宿主的健康和体内平衡起着不可磨灭的作用。近年来，越来越多的人类和动物研究表明肠道轴的存在，并认识到肠道关节轴和胃肠道微生物组诱导的免疫和炎症反应在关节健康中起着重要作用。研究者已经表明，正常的人类肠道微生物组由两个主要门组成，拟杆菌门和厚壁菌门。拟杆菌通过促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化在骨骼保护中发挥作用。在我们的结果中，与假手术组相比，拟杆菌和厚壁菌门在OA-OP组中被下调；然而，这种情况在PAL管理后恢复了。乳酸杆菌被认为是一种有益细菌，它通过调节促炎细胞因子和与骨代谢相关的标志物来潜在影响免疫相关的骨骼健康。穆氏杆菌科属于拟杆菌门，由Ilias等人重新命名，研究表明，间歇性甲状旁腺激素 (PTH) 可以增加穆氏杆菌科的丰度并增加OVX大鼠的骨量。流行病学分析表明，毛螺菌科的丰度在低骨密度 (BMD)的人群中减少了。我们的研究表明，PAL的使用增加了OA-OP大鼠中放线菌门、乳酸杆菌、毛螺菌科和穆氏杆菌科的丰度。
我们的结果证明了PAL改善大鼠OA和OP双模型的潜力，其中多种肠道微生物和代谢物可能在恢复机制中发挥作用。然而，本研究有一些局限性，包括样本量有限，以及鉴定出的细菌和代谢物不能被描述为OA-OP大鼠的生物标志物。因此，本研究结果只能为探索骨质疏松和骨关节炎炎症大鼠骨量减少和软骨退变的机制提供一些参考，尚需大样本研究验证。在动物实验中，我们以后会进一步加入不同的给药浓度和阳性对照药物，以提高我们结论的可靠性。此外，我们将在未来通过额外的实验探索GM和代谢物对OA-OP的影响。
结论
总之，PAL可以改善OA-OP大鼠的软骨退化和骨量丢失，潜在的作用机制可能与改善肠道菌群生态失衡和平衡苯丙氨酸/酪氨酸代谢紊乱有关。此外，作为两种常见的与年龄有关的疾病的共同机制，GM具有潜在的作用。本研究中检测到的GM的关键属可能有助于确定GM中关节退化和骨质流失的潜在治疗靶点。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2023.1153360/full
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
