导读
黄芪是一种药食两用草本植物。黄芪的主要成分黄芪甲苷IV（AS-IV）对缺血性卒中（IS）具有神经保护作用，但其作用机制尚不清楚。我们的研究使用短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型对受缺血影响的大脑一侧进行纵向多组学分析。基于转录组学和蛋白质组学分析，我们发现396个差异表达靶点上调，114个差异表达靶点下调。基于代谢组学，我们共鉴定出117种不同的代谢产物。最后，我们使用Cytoscape 3.7.1的Metscape插件找到了8个与化合物-反应-酶-基因网络相对应的关键基因。我们发现相关的关键代谢产物为3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、2-氨基粘康酸半醛、（R）-3-羟基丁酸等，受影响的途径为酪氨酸代谢、色氨酸代谢、丁酸代谢、嘌呤代谢等。我们使用4D-PRM蛋白质组学进一步验证了这些靶点，发现七个靶点存在显著差异，包括Aprt、Atic、Gaa、Galk1、Glb1、Me2和Hexa。本研究通过结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合策略，揭示了AS-IV治疗缺血性脑损伤的机制。
论文ID
原名：Integrated transcriptomics, proteomics and metabolomics to identify biomarkers of astragaloside IV against cerebral ischemic injury in rats
译名：整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学，鉴定黄芪甲苷抗大鼠脑缺血损伤的生物标志物
期刊：Food & Function
IF：6.317
发表时间：2023.3
通讯作者：周惠芬 & 杨洁红
通讯作者单位：浙江中医药大学
实验设计
实验结果
1. AS-IV改善大鼠MCAO后的神经功能缺损并减少梗死体积
如图2A所示，对照组、MCAO组和As-IV治疗组在神经功能缺损评分方面表现出显著差异。与对照组相比，5天的药物治疗导致MCAO组的神经功能缺损显著更高（p＜0.001），而AS-IV组的神经功能缺损较低（p＜0.001）。
如图2（B和C）所示，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色将活组织染色为深红色，而右脑半球的梗死区域为白色。与对照组相比，MCAO组的梗死体积显著增加（p＜0.001），AS-IV组的梗死面积显著减少（p＜001）。
图1 图形摘要
2. 脑缺血后不同丰度蛋白质和基因的综合分析
对照组、MCAO组和AS-IV组中反向上调的基因表达水平类似于“V”形，统计转录组和蛋白质组一致性逆转上调的靶点；我们共筛选了396个差异表达基因（DEGs），差异表达基因的详细信息见表S1（ESI†）；对照组、MCAO组和AS-IV组中反向下调的基因表达水平接近模拟“∧”的形状。统计转录组和蛋白质组一致逆转下调的靶点。我们共选择了114个DEGs，差异表达基因的详细信息见表S2（ESI†）。
图2 AS-IV对MCAO大鼠神经功能缺损和脑梗死体积的影响
（A）对照组、MCAO组和AS-IV组的神经功能评分。数值表示为平均值±标准差（n=6）。（B）对照组、MCAO组和AS-IV组的TTC染色冠状脑切片的代表性照片。（C）对照组、MCAO组和AS-IV组脑梗死体积的统计结果（n=3）。***与对照组比较，p＜0.001；与MCAO组比较，###p＜0.001。
3. 差异代谢产物鉴定和通路分析
我们在LC-MS正离子模式下共鉴定出573个生物标志物，在负离子模式下鉴定出410个生物标志物。筛选条件：（1）VIP≥1；（2）倍数变化FC≥1.2或≤0.8333；（3）当Q值<0.05时，获得共有离子（差异离子）。我们将差异离子与代谢物数据库HMDB中的物质分子进行匹配，并结合数据库KEGG中的信息进行生物标志物鉴定，最终鉴定出117种差异代谢物（表S3）（ESI†）。
图3 代谢途径富集图(影响>0.2)
我们使用MetaboAnalyst 5.0对这些差异代谢产物和转录组之间筛选的差异表达基因进行途径富集，以获得代谢途径富集图，并在途径图上标记影响程度（影响>0.2，p<0.05）（图3）。最终认为AS-IV可以通过调节嘌呤代谢、鞘脂代谢、酮体的合成和降解、丁酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢来治疗大鼠脑缺血再灌注损伤。与这些途径相关的代谢产物是鞘磷脂、半乳糖神经酰胺、葡萄糖神经酰胺、（R）-3-羟基丁酸、D-4-羟基-2-氧戊二酸等。表1列出了与这些代谢途径相对应的靶标和代谢物。
表1 代谢途径匹配的化合物和基因
4. 代谢组学和潜在靶标的综合分析
我们将已鉴定的差异表达基因与差异代谢产物的一致性导入Cytoscape 3.7.1的Metscape插件中，共鉴定出98个差异表达基因和26个差异代谢产物。
使用STRING11.5，我们构建了一个PPI网络来鉴定AS-IV在抗脑缺血再灌注损伤中的关键基因。图4A显示了87个靶点内的总体关系（其他11个基因未连接）。我们使用Cytohubba计算Hub基因，并通过结合MCC算法（Hsd17b4、Acox1、Hmgcl、Acadl、Cat、Crat、Acads、Amacr、Pccb、Prkacb、Aprt、Gmps、Ndufa4、Ndufb4、Ndufb3、Ndufa5、Nduga6、Entpd3、Umps和Atic）将前20个基因视为Hub基因。
表2 主要靶点和代谢物
为了解释共有差异表达基因的总体功能，我们使用ClueGo研究了潜在靶标的KEGG和GO富集分析（图第4B和C段）。根据KEGG富集分析，受显著影响的途径是糖胺聚糖降解、PPAR信号通路、丁酸代谢和谷胱甘肽代谢。GO分析中最重要的术语是嘌呤核糖核苷酸代谢过程（GO:0009259）、多元醇代谢过程（GO：0019751）和辅酶结合（GO:00050662）。
为了充分了解AS-IV治疗脑缺血再灌注损伤的机制，我们构建了一个基于转录组学、蛋白质组学和代谢组学的化合物-反应-酶-基因相互作用网络（图5）。将差异代谢物引入Cytoscape 3.7.1数据库的Metscape插件中，以收集化合物-反应-酶-基因网络。通过将转录组学和蛋白质组学鉴定的潜在差异表达基因与Metscape分析中的基因进行匹配，我们发现了18个关键靶点（表2）。其中，Hsd17b4、Acox1、Cat、Acads、Amacr、Aprt、Entpd3和Atic是关键你基因。相关的关键代谢产物为3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、（R）-3-羟基丁酸、S-乙酰基二氢硫酰胺、葡糖神经酰胺等（表2）。受影响的途径是酪氨酸代谢、色氨酸代谢、丁酸代谢、嘌呤代谢、糖酵解和糖异生、糖脂代谢、甘油磷脂代谢、糖脂生物合成-神经节系列和半乳糖代谢。它们可能在AS-IV对脑缺血再灌注损伤的治疗作用中发挥重要作用。
图4 （A）不同表达基因的PPI网络（红色和橙色代表前20个关键基因，紫色代表非前20个关键基因）。（B）Cluego的KEGG通路富集分析。KEGG通路分析设定为pV值≤0.05。（C）潜在靶点的GO富集分析。
5. 通过4D PRM定量蛋白质组学分析验证候选靶点
为了进一步可靠和定量地分析潜在的关键靶点候选者，我们采用了PRM-PASEF模式来利用TIMS进行四维分离（图6）。PRM分析发现18个关键靶点，其中7个具有统计学意义，包括Aprt、Atic、Gaa、Galk1、Glb1、Me2和Hexa。此外，与对照组相比，MCAO组上述所有关键靶点的表达水平均显著上调；与MCAO组相比，AS-IV组的所有表达水平均下调，最重要的是，这些关键靶点的PRM结果与转录组和蛋白质组反向下调的实验数据一致。这些结果表明AS-IV和关键靶点之间具有高度的亲和力，尤其是Aprt和Atic。
图5 关键代谢产物和靶点的化合物-反应-酶-基因网络
深红色的六边形代表关键代谢产物，深蓝色的圆圈代表关键靶标。
图6 不同表达的蛋白质的PRM分析；具有显著差异的关键靶点是Aprt、Atic、Gaa、Galk1、Glb1、Me2和Hexa（n＝3）。与对照组相比，**p＜0.01和***p＜0.001；与MCAO组相比，##p＜0.01和###p＜0.001。
讨论
先前的研究表明，AS-IV在脑I/R损伤期间发挥了神经保护作用，主要是通过其抗氧化、抗炎和抗凋亡的生物活性。然而，AS-IV在脑I/R过程中的信号通路很少且并未被完全报道。研究人员越来越多地依赖代谢组学来研究疾病机制和干预策略。代谢组学旨在研究潜在代谢产物和相关途径的列表。转录组学和蛋白质组学的结合可以进一步验证代谢网络的治疗调节，并有助于识别关键靶点和生物标志物。因此，我们开发了一种综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合策略，以探索AS-IV治疗缺血性脑损伤的关键靶点和机制。化合物-反应-酶-基因网络揭示了18个关键靶点以及相关的代谢产物和途径。经过4D PRM靶向蛋白质组学的进一步验证，得出结论，7个靶点（Aprt、Atic、Me2、Glb1、Hexa、Gaa和Galk1）和5种代谢途径（嘌呤代谢、半乳糖代谢、糖脂代谢、糖酵解和糖异生以及糖脂生物合成-神经节系列）在缺血性脑损伤的AS-IV治疗中发挥了重要作用。
嘌呤代谢是哺乳动物脑损伤后大脑生物能量支持的有效途径；一个原因是腺嘌呤和核糖可以被脑组织用来提升细胞ATP，这具有功能性后果，尤其是通过释放更多的腺苷（一种具有神经保护和抗惊厥活性的血管扩张分子）。腺嘌呤磷酸核糖转移酶（Aprt）是参与嘌呤挽救的关键酶；Aprt催化腺嘌呤和5-磷酸核糖基-1-焦磷酸盐（PRPP）形成AMP和无机焦磷酸盐。外源腺嘌呤显示出通过APRT合成代谢调节AMPK细胞活性的潜力。嘌呤代谢的另一个重要靶点是氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶。IMP环状水解酶（Atic）是一种催化酶。Atic是一种含有转化结构域的胞浆酶，该结构域将甲酰基转移到AICAR以产生中间体甲酰基AICAR（FAICAR）。有充分的证据表明，抑制Atic将减少内源性5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷-5-一磷酸盐（ZMP）的形成，从而减缓ZMP及其前体AICAR的代谢，降低AICAR诱导的AMPK激活的阈值，并增强葡萄糖摄取和脂质氧化。总之，Aprt和Atic都与嘌呤代谢中的AMPK通路有着千丝万缕的联系。研究发现，在脑缺血的情况下，AMPK的激活可以调节细胞凋亡，进而对神经元细胞产生保护作用。同时，一些研究表明，AS-IV可以激活AMPK-PGC-1α信号通路，调节Bcl-2家族蛋白，增强能量代谢。在这项研究中，Aprt和Atic在脑缺血损伤期间上调，但在AS-IV治疗后下调（图6）。这提供了新的证据，证明AS-IV的潜在机制是通过AMPK信号通路发挥其抗脑缺血作用。
当大脑发生急性缺血性损伤时，糖酵解和糖异生会中断，导致不良副产物的积累。这些副产物，包括乳酸和活性氧，会导致细胞损伤和死亡。苹果酸酶（MEs）被认为是糖异生和糖酵解的关键，其原理是MEs通过将克雷布斯循环中间体苹果酸转化为丙酮酸盐和NADPH参与氧化还原平衡、细胞能量和分子生物合成的调节。苹果酸酶（Me2）是苹果酸酶的一种异构体。多项研究的证据表明，Me2通过调节多种信号通路，在癌症细胞的生长、增殖、侵袭和生存中发挥着重要作用。据报道，Me2可调节AMPK、Akt途径、p53表达、谷氨酰胺氧化和ROS产生。尽管很少有文献报道Me2在脑缺血中的作用，但它与脑缺血损伤的多种分子机制有关，因此Me2也被认为是未来研究的潜在靶点。研究人员发现了一些关于AS-IV对抗脑缺血损伤的信号通路，AS-IV通过钙蛋白酶-1/SIRT1/AMPK信号通路抑制氧化应激和线粒体功能障碍的发生；AS-IV通过PI3K/Akt途径刺激血管生成。这些类似于Me2调节的分子机制。根据我们的多组学分析，Me2是糖酵解和糖异生代谢的关键靶点，在AS-IV对抗脑缺血损伤中发挥着重要作用。这为Me2与缺血性损伤之前的大脑之间的联系提供了新的证据。
鞘糖脂生物合成-神经节苷脂途径与缺血性中风的发病机制有关。此外，在许多疾病中，如癌症、糖尿病、神经退行性变和心血管疾病，细胞和生物体内稳态的失衡与鞘脂代谢有关。半乳糖苷酶-1（Glb1）基因编码分解GM1神经节苷脂的β-半乳糖苷酶。GM1神经节苷脂的异常储存可能通过未折叠蛋白反应（UPR）、内质网钙信号通路、自噬和炎症小体激活影响神经元功能。我们的研究结果提供了一个新的视角，即GLB1可能是一个潜在的治疗靶点，通过调节GM1的代谢来保护脑缺血后的细胞神经元功能。β-环己糖苷酶（HEX）负责鞘糖脂神经节苷脂GM2的转化。HEX有三种不同的异构体，由Hexa和Hexa两个位点的组合表达产生：Hexa、Hexb和Hexs。研究人员发现，小鼠局灶性脑损伤（如创伤性脑损伤或中风）后，脑损伤部位的GM2表达升高。尽管在相关文献中尚未报道Hexa与脑缺血之间的联系，Hexa参与GM2的转化，因此Hexa可能是未来脑缺血再灌注研究的潜在靶点。
半乳糖代谢与脑缺血的发病机制有关。研究人员发现老年中风患者的半乳糖代谢发生了显著变化，这与我们的组学研究结果一致。II型糖原储存病是由溶酶体酸性葡萄糖苷酶基因（Gaa）引起的，该基因对溶酶体中糖原产生葡萄糖进行催化。在脑缺血能量危机期间，脑糖原迅速降解以满足能量需求。脑缺血期间糖原分解的速率是静息状态的200倍。在缺血条件下，脑糖原是糖酵解底物的重要来源，一旦糖原耗尽，脑功能可能遭受不可逆的损伤。据报道，在大鼠大脑中动脉闭塞期间，糖原储存增加和乳酸生成减少可减少皮层梗死面积。尽管文献中没有关于Gaa与脑缺血之间关系的报道，但也有理由推测Gaa通过糖原的代谢参与脑缺血的发病机制。该实验的4D PRM结果表明，AS-IV中Gaa的表达下调，可能通过增加糖原储存来减少缺血性损伤。半乳糖激酶1（Galk1）是半乳糖代谢的另一个重要靶点，是GHMP激酶家族中的一种小分子激酶，它催化α-D-半乳糖C-1羟基的MgATP依赖性磷酸化，在Leloir途径中产生Gal-1-P，与细胞的能量代谢有关。因此，尽管Galk 1与脑缺血之间的文献报道很少，但Galk 1仍然被认为是一个潜在的靶点。
总之，与AS-IV抵抗脑缺血机制密切相关的代谢途径是嘌呤代谢、糖酵解和糖原生成、鞘糖脂生物合成-神经节苷脂途径和半乳糖代谢。这些代谢途径中的关键靶点分别是Aprt、Atic、Me2、Glb1和GAA，现有证据表明，它们或多或少与AS-IV对抗脑缺血的多种作用机制有关。本研究还确定了AS-IV对抗脑缺血的新作用机制、糖脂生物合成的关键靶点Hexa和半乳糖代谢的关键靶点Galk1。目前关于它们的文献报道不多，有望成为未来研究的新方向。
结论
在本研究中，我们发现缺血侧脑组织中七种蛋白质和相应代谢物的调节水平受到影响，AS-IV治疗可改善这些异常。根据我们的研究，我们已经确定了As-IV抗脑缺血损伤的七个靶点（Aprt、Atic、Gaa、Galk1、Glb1、Me2和Hexa）和五种代谢途径（嘌呤代谢、半乳糖代谢、糖脂代谢、糖酵解和糖异生以及糖脂生物合成-神经节系列）。这些物质大多反映了炎症和能量供需的变化，以及神经退行性疾病的病理生理进展。最后，我们旨在通过分别结合多组学、小分子和生物信息学分析来掌握生物体病理机制的总体变化。我们为多靶点AS-IV的合理应用提供了参考，它可以作为治疗脑综合征的一种选择。
原文链接：
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