背景：
上皮紧密连接定义肠屏障的细胞旁通透性。分子可以通过两种不同的尺寸选择性和电荷选择性的细胞旁途径穿过紧密连接：孔隙途径和渗漏途径。可通过其选择性和免疫细胞的差异调节来区分。然而，大多数研究中测量到的通透性增加是继发于上皮损伤，这允许非选择性的流量通过非限制性途径。增加的非限制性通路通透性的恢复需要黏膜愈合。相反，紧密连接屏障的丧失可以通过针对性的干预来逆转。需要特定的方法来恢复孔隙途径或渗漏途径的渗透性增加。最近的研究使用临床前疾病模型证明了疾病中孔隙通路或渗漏通路屏障修复的潜力。
简介：
2023年4月25日，来自美国哈佛医学院布列根和妇女医院病理科粘膜屏障病理生物学实验室的Jerrold R. Turner教授课题组在Nat Rev Gastroenterol Hepatol（IF: 73.0）杂志上发表题为“Paracellular permeability and tight junction regulation in gut health and disease”的文章[1]。在这篇文章中，作者重点讨论了依赖于紧密连接的两条细胞旁流量通路。讨论了关于紧密连接成分、结构和调节机制的最新证据，它们对肠道健康和疾病的影响，以及治疗干预的机会。
主要结果：
疾病中的肠道通透性。
在许多肠道和全身疾病中，肠道通透性增加，即屏障功能降低。在这些疾病中，研究最多的肠道疾病是炎症性肠病(IBD)和乳糜泻。虽然紧密连接通透性在IBD中增加，但在晚期活动性疾病中观察到的广泛屏障丧失更有可能反映上皮损伤。同样，在晚期移植物抗宿主病(GVHD)中，肠道通透性增加可反映紧密连接调节或免疫介导的上皮损伤。虽然有可能区分这些不同的屏障丧失机制，但大多数研究仅依赖于使用单一探针(如小鼠模型中的异硫氰酸荧光素-4-KDa右旋糖酐)来测量通透性。因此，数据不足以区分渗漏通路和非限制性通路通量。因此，在IBD、乳糜泻和GVHD中观察到的屏障丧失程度和疾病严重程度之间的相关性最有可能继发于上皮损伤。相比之下，克罗恩病缓解期的肠道通透性增加更有可能反映紧密连接通透性增加，特别是通透性增加可在疾病再激活前长达1年。值得注意的是，心理应激可增加啮齿类动物的肠道通透性，是患者克罗恩病再激活的危险因素。
紧密连接与肠屏障功能。
在没有上皮损伤的情况下，紧密连接是被动细胞旁转运的限速决定因素。在紧密连接时，相邻细胞之间的细胞间隙被消除，相邻上皮细胞的质膜脂质双分子层的外小叶紧密贴合，似乎融合在一起。紧密连接的顶端下是黏附连接和桥粒，它们分别与基于肌动蛋白的微丝和基于细胞角蛋白的中间丝连接。这些细胞骨架结构提供了支持紧密连接和维持细胞形状的抗拉强度。
紧密连接途径和蛋白质。
第一个被发现的紧密连接蛋白是闭锁小带蛋白1 (zonula occludens 1, ZO-1)(图1)，随后是两个相关的蛋白ZO-2和ZO-3，以及不相关的蛋白扣带蛋白，尽管这些蛋白都是细胞内的外周膜蛋白。在这些发现之后，四跨膜紧密连接蛋白occludin和claudin被发现，它们在哺乳动物中由27个基因编码。
图1：紧密连接的结构和形态
孔隙和渗漏通路在健康中的作用。
在肠上皮内表达的主要成孔性claudin是claudin-2和claudin-15，两者均形成阳离子选择通道。缺少claudin-2或claudin-15的小鼠是可以存活的，但同时缺乏这两种claudin的小鼠在断奶前就会死亡，这与这些蛋白质(至少部分)在功能上是多余的这一观点是一致的。然而，claudin-15基因敲除的小鼠发生肠道肥大，而claudin-2基因敲除的小鼠未发生。
通过claudin-2和claudin-15通道的细胞旁Na+外流对跨细胞营养转运至关重要。刷状缘吸收主要由依赖于肠腔和上皮细胞细胞质之间Na+梯度的Na+ -营养协同转运蛋白驱动(图2)。在这一过程中，Na+进入细胞质，并通过Na+ -K + ATP酶跨基底外侧膜进入固有层。在缺乏细胞旁Na+转运的情况下，跨细胞转运迅速耗尽管腔内Na+和营养物质的协同转运，并停止通过顶端刷状缘膜。通过claudin-2和claudin-15通道的通量允许Na+从固有层外流到管腔，在那里它可以驱动额外的Na+ -营养共转运循环。
图2：跨细胞和细胞旁转运的协调
疾病中的孔隙途径。
肠上皮claudin-2因其在多种炎症性疾病中表达显著增加而受到密切关注。Claudin-2上调首先在溃疡性结肠炎和克罗恩病中被描述。随后的研究表明，肠上皮claudin-2在乳糜泻、肠易激综合征、HIV肠病、肠道感染、坏死性小肠结肠炎和Whipple病中也上调。介导claudin-2上调的因素还不完全清楚，但在体外和体内的研究表明，IL-1, IL-6, IL-13, IL-22和肿瘤坏死因子(TNF)是claudin-2表达的潜在增强因子。相反，一些体外研究表明丁酸可以通过IL-10受体依赖的机制抑制claudin-2的表达并增加屏障功能。总之，这些数据表明黏膜免疫系统可以微调claudin-2的表达。
给予小鼠重组IL-13可增加claudin-2的表达并增强肠旁细胞阳离子的通透性。同样，肠上皮内的转基因claudin-2过表达增加了对阳离子的细胞旁通透性，达到与il -13处理的野生型小鼠相似的水平。相比之下，IL-13对编码Cldn2的基因敲除小鼠的肠道通透性没有影响。因此，claudin-2的上调对于增加细胞旁阳离子的通透性是必要和充分的。
疾病中的渗漏途径。
虽然在Na+ -营养盐共转运过程中，渗漏途径在生理上被激活，但TNF可诱导渗漏途径渗透性的更大增加。生理和病理生理学紧密连接调节的这种差异的原因尚不清楚，因为两者都依赖于MLCK的激活，但它们可能与以下事实有关:在TNF诱导的屏障丢失期间，occludin内吞发生，但在Na+ -营养共转运诱导的通透性增加期间，occludin分布不受影响。在由TNF相关细胞因子LIGHT, IL-1β或脂多糖引起的MLCK介导的屏障丢失过程中，Occludin也被内化。
在免疫介导的实验性IBD中，肠上皮MLCK的激活加速了疾病进展，而肠上皮MLCK的基因缺失可减轻疾病。有趣的是，在实验性免疫介导的IBD中，claudin-2的上调在缺乏肠上皮MLCK的小鼠中减少，并且可通过肠上皮内组成型活性MLCK的转基因表达恢复。因此，在疾病中，渗漏途径和孔隙途径是相互联系的。值得注意的是，肠上皮细胞中组成型活性MLCK的转基因表达小幅增加了渗漏通路的通透性，但不会诱发疾病，增加了黏膜IL-13的生成和上皮claudin-2的表达。因此，渗漏途径的通透性增加可以通过黏膜免疫激活触发claudin-2的上调。
图3：通过细胞旁液外流促进病原体清除
募集MLCK1的靶向治疗。
divertin在免疫介导的IBD小鼠模型中显著有效，其效果在包括生存期在内的所有指标上均等同于或优于抗TNF疗法。这一结果支持以下假设:憩室蛋白介导的干扰IgCAM3介导的蛋白-蛋白相互作用可阻止连接周围的MLCK1募集，并最终阻止疾病进展。
通过筛选潜在的MLCK1结合伴侣来鉴定divertin蛋白靶向的蛋白-蛋白相互作用。这一过程导致了他克莫司结合蛋白FKBP8作为MLCK1相互作用蛋白的发现(图4)。在TNF处理的肠上皮单层培养物中，MLCK1- FKBP8相互作用特异性增加。这些相互作用往往发生在周围肌动球蛋白环附近。同样，在克罗恩病患者的活检样本中，作者检测到交界周围的MLCK1 - FKBP8相互作用增加。他克莫司还可预防TNF诱导的人肠道类器官中MLCK1募集、MLCK1 - FKBP8相互作用和MLC磷酸化。最后，他克莫司可预防小鼠急性T细胞活化后MLCK1募集、occludin内化和屏障丢失。令人惊讶的是，在体外，divertin并没有干扰FKBP8与重组MLCK1 IgCAM结构域1到4的结合。因此，尽管divertin对实验性结肠炎有效，但可防止MLCK1与FKBP8或其他MLCK1结合伴侣相互作用的药物也应作为潜在的治疗药物。
图4：上皮细胞和平滑肌肌球蛋白轻链激酶
结论和展望：
总之，我们对孔隙和渗漏途径的渗透性如何影响健康和疾病的理解仍然相对初级。因此，虽然已经取得了许多成就，但还有更多的东西有待发现。剩下的挑战包括识别渗漏通路的位点和分子结构，阐明看似冗余的紧密连接蛋白之间必然存在的差异，以及定义非经典紧密连接蛋白的功能。然而，靶向紧密连接的治疗方法的前景仍然令人瞩目，这些治疗方法的实施也越来越近。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41575-023-00766-3
参考文献：
[1] Horowitz, A., Chanez-Paredes, S.D., Haest, X. et al. Paracellular permeability and tight junction regulation in gut health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol (2023). https://doi.org/10.1038/s41575-023-00766-3.
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