以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种慢性非特异性的肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn’s disease, CD）。UC的发病病灶在结肠以及浅表黏膜炎症向近端连续延伸，可导致溃疡、大出血、中毒性巨结肠和暴发性结肠炎；而CD可累及消化道的任何部分，病变通常不连续，以透壁性炎症为特征，可导致消化道纤维化狭窄、瘘管和脓肿等并发症。临床上，IBD的治疗手段主要包括非靶向疗法（如氨基水杨酸盐、糖皮质激素和免疫调节剂）和靶向生物疗法（如抗TNF制剂）。遗憾的是，这些药物仅为对症治疗而不能治愈疾病。因此，发展IBD诊疗新技术、新方法，将为其综合防治提供有效依据，具有重大的社会需求。
活性氧（reactive oxygen species, ROS）是体内一类氧的单电子还原产物，包括超氧阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）等。在IBD发生发展过程中，炎症反应产生大量ROS，除了直接造成肠黏膜组织损伤外，还会诱导结肠上皮细胞发生氧化应激，造成多种脂质过氧化，脂质过氧化的产生又进一步损伤结肠上皮；ROS同时还具有趋化能力，招募中性粒细胞等免疫细胞进入炎症部位，刺激促炎因子的大量分泌，从而放大肠道炎症反应，导致损伤加剧。此外，细胞粘附分子家族受到过氧化刺激时，表达水平迅速上升，同样会招募免疫细胞进入炎症部位导致病情恶化。炎症部位ROS水平升高是IBD发生发展的主要致病机制之一。因此，清除ROS、降低氧化应激反应，是治疗IBD的重要手段。
体内天然抗氧化酶体系主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）等，这几种酶共同组成机体完整的抗氧化链条，在生理条件下将ROS控制在正常水平。然而，大部分天然酶的本质是蛋白质，这也决定了其固有的缺陷，如易变性或活性易丧失、纯化过程繁琐以及难以储存回收等。纳米酶是一类自身蕴含酶学特性的纳米材料，与天然酶相比，纳米酶具有更好的理化稳定性、通用性和可循环性。因此，设计纳米酶通过有效清除炎症部位ROS，有望实现IBD的抗氧化治疗。
西安交通大学张明真研究团队与第四军医大学西京医院梁洁教授团队合作，通过热溶剂法，利用谷胱甘肽和生物素合成了一种多功能碳点纳米材料（图1）。该碳点具有良好的SOD酶活性，羟基自由基清除能力及较好的荧光性能。在IBD模型中，该纳米酶不但可以改善肠道炎症，且可以用于肠道在体荧光成像。因此，该研究拓展了抗氧化纳米酶在IBD治疗中的应用。
图1. 兼具荧光成像和ROS清除能力的碳点纳米酶的合成及其在IBD治疗中的应用。（A）碳点的合成。（B）碳点在IBD治疗中的应用。
研究内容
1. 碳点的合成与表征
由图2B可以看出，合成的碳点为球形，统计结果显示其粒径为3.1±0.5 nm。高分辨透射电镜结果显示碳点的晶格间距为0.21 nm。X射线光电谱学和傅里叶红外光谱（图2C、D）结果表明，该碳点含有丰富的官能团。此外，碳点的电位为-24.8 mV（图2E），表明该碳点具有胶体稳定性。
图2. 碳点的表征及ROS清除能力。(A) C-dots的合成路线图；(B) C-dots的透射电镜图以及高分辨透射电镜图；(C) C-dots的X射线光电能谱；(D) C-dots的傅里叶变换红外光谱；(E) C-dots的Zeta电位；(F) C-dots的紫外可见光谱，荧光发射光谱以及C-dots在白光和紫外光下的
；(G) C-dots 在不同pH值下的荧光光谱；(H) 不同浓度 C-dots 总的抗氧化能力；(I) 不同浓度C-dots 的类SOD酶活性；(J) C-dots的•OH清除能力。
2. 碳点的光学性质
由图2F可以看出，合成的碳点溶液为绿色，在紫外光照射下，碳点发射出红色的荧光。紫外可见光谱结果显示该碳点有广泛的吸收。且在420 nm的激发波长下，碳点在680 nm处有发射峰。此外，该碳点的发射光谱在中性及微酸性的pH缓冲液中保持稳定（图2G）。
3. 碳点的ROS清除能力
通过ABTS、WST以及MB等实验评估碳点的ROS清除能力。结果表明，该碳点具有较好的活性氧清除能力，能够清除O2•−和•OH（图2H-J）。
4. 体外抗炎抗氧化能力
基于上述碳点良好的活性氧清除能力，首先在细胞水平验证了碳点的抗炎抗氧化能力。从图3B-D可以看出，LPS诱导巨噬细胞RAW264.7细胞后与DCFH探针孵育，绿色荧光明显增加，而碳点处理的细胞中绿色荧光明显减少，表明该碳点能够清除细胞水平产生的ROS。此外，该碳点能够保护细胞免受氧化损伤（图3E、F），降低LPS诱导的促炎细胞因子的表达（图G）。表明该碳点能够通过抗炎抗氧化作用改善体外炎症。
图3. 碳点的体外抗炎抗氧化能力。（A）细胞实验流程图；（B）不同处理下RAW264.7细胞与DCFH探针孵育后的荧光
；（C）图B的荧光统计结果；（D）B 图对应的流式结果；（E）H2O2和C-dots处理后RAW264.7细胞的细胞活率；（F）H2O2和C-dots处理后Colon-26细胞的细胞活率；（G）促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）的mRNA表达。
5. 碳点在体荧光成像
健康小鼠给予不同浓度的碳点后，在不同时间点进行活体及离体成像（图4A、B）。结果显示该碳点能够进行活体成像，并分布在肾脏、肝脏、肺以及结肠部位（图4C）。体内药物代谢实验结果统计表明该碳点的半衰期为11.5h（图4D）。接下来，对健康小鼠及IBD（UC和CD）模型小鼠给予碳点，并进行离体成像（图4E），发现炎性环境不影响碳点的成像（图4F、G）。因此，该碳点能够用于体内成像。
图4. 碳点的体内荧光成像。（A）健康小鼠给予C-dots后不同时间点的活体成像
；（B）不同时间点离体器官的成像
；H：心脏；Li：肝脏；S：脾脏；Lu：肺；K：肾脏。（C）B图离体器官荧光统计结果；（D）C-dots的药物代谢曲线；（E）健康小鼠和两种IBD模型小鼠离体器官荧光成像
；（F）E图主要器官荧光统计结果；（G）E图结肠荧光统计结果。
6. 碳点在溃疡性结肠炎（UC）小鼠中的治疗效果
基于体外良好的抗炎抗氧化效果，通过DSS诱导建立了小鼠UC模型（图5A）。结果表明，该碳点能够恢复结肠结构、结肠长度，减少炎性细胞的浸润和结肠部位的ROS，降低结肠部位促炎细胞因子的表达（图5B-H）。因此，该碳点能够有效改善溃疡性结肠炎。
图5. 碳点在UC模型中的治疗效果。（A）C-dots治疗UC小鼠的流程图；（B）小鼠体重变化；（C）结肠长度；（D）内窥镜
；（E）HE染色；（F）病理学评分；（G）DHE染色；（H）促炎细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-12）的mRNA表达。
7. 碳点在克罗恩（CD）小鼠模型中的治疗效果
IBD主要有UC和CD两种类型，随后在TNBS诱导的克罗恩小鼠模型中评估了碳点的治疗效果（图6A）。结果表明，该碳点同样能恢复TNBS小鼠结肠结构、结肠长度，减少炎性细胞浸润，降低促炎细胞因子的表达（图6B-H）。因此，该碳点能够有效地改善克罗恩疾病。
图6. 碳点在克罗恩模型中的治疗效果。（A）C-dots治疗CD小鼠的流程图；（B）小鼠体重变化；（C）结肠
；（D）结肠长度；（E）内窥镜
；（F）HE染色；（G）病理学评分；（H）促炎细胞因子（TNF-α, IL-12）的mRNA表达。
8. 碳点的生物相容性
健康小鼠注射不同浓度的碳点，30天后，获得小鼠的血液进行血常规及生化指标分析，获取小鼠的主要器官进行HE染色。结果表明，碳点处理的小鼠与对照小鼠比，血常规、生化指标以及主要器官结构均没有明显的差异（图7），说明该碳点具有良好的生物相容性。
图7. 碳点的长期生物相容性。（A）血常规指标的浓度；（B）血生化指标的浓度；（C）主要器官的HE染色。
结论与展望
该研究合成了一种基于谷胱甘肽和生物素的碳点纳米酶。合成碳点具有良好的SOD类酶活性、羟基自由基清除能力，以及较好的荧光成像性质。该碳点纳米酶不仅能够清除过量的ROS，保护细胞免受氧化损伤，同时缓解IBD的炎症。这种没有明显系统毒性的碳点纳米酶为IBD的治疗提供了新的方法，并有望实现长期的炎症缓解。
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