ACS Chem. Biol. | HiBiT-SpyTag：一种兼顾小尺寸和多功能的新型标签蛋白降解平台

英文原题：HiBiT-SpyTag: A Minimal Tag for Covalent Protein Capture and Degrader Development

供稿人：马毅骢 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“HiBiT-SpyTag: A Minimal Tag for Covalent Protein Capture and Degrader Development”，文章的通讯作者是来自丹娜—法伯癌症研究所以及哈佛医学院的 Lyn H. Jones 教授，Breanna L. Zerfas 教授和 Radoslaw P. Nowak 教授。以 PROTAC、Molecular Glue 为首的靶向蛋白降解技术在成药过程中经常遇到一类问题，即成药前难以预测疾病靶点的可降解性与降解后的生物学效应，这催生了基于蛋白质标签的通用型降解技术的发展。例如 dTAG 技术，它使用一种被称为 dTAG-13 的 PROTAC 分子来降解带有 FKBP12 标签的目标蛋白。这类技术的优势在于，研究者仅需通过基因编辑技术将蛋白标签与疾病靶点融合表达，即可实现靶点降解与治疗效果表征。遗憾的是，常见标签系统的分子量较大（>12 kDa），这不仅提高了基因编辑的操作难度，也增加了标签蛋白对疾病靶点生理、病理功能干扰的风险。因此，作者团队开发了一种长度仅为 24～25 个氨基酸的肽段标签系统 HiBiT-SpyTag。它既能通过其 HiBiT 部分产生生物发光信号用于表征靶点蛋白的表达量、残留量，也能通过其 SpyTag 与 SpyCatcher 蛋白的共价结合实现靶点蛋白的降解。实验结果表明，HiBiT-SpyTag 系统可以高效降解组蛋白乙酰化读取蛋白 BRD4，以及尚未有降解报道的全新靶点-内质网核信号转导蛋白 IRE1A。基于 HiBiT-SpyTag 的降解测试结果，作者团队进一步发展了针对 IRE1A 的 PROTAC 小分子药物，并在体外试验中表征了其靶点特异性和降解高效性。本工作提供了一套在标签降解系统指导下开发全新 PROTAC 药物的工作流程，而得益于 HiBiT-SpyTag 高度模块化的设计，它亦可被用于多种依赖蛋白间共价交联的体系（图 1）。

图1.  HiBiT-SpyTag 降解平台的运作机理示意图

HiBiT-SpyTag 标签由两个功能模块组成。其中，HiBiT 部分长度为 11 个氨基酸，它可与 LgBiT 蛋白结合并形成一个具有功能的 NanoLuc 荧光素酶；SpyTag 部分长度为 13～14 个氨基酸，它能通过天冬氨酸残基的侧链与 SpyCatcher 蛋白活性中心的赖氨酸残基的侧链形成酰胺键，产生共价交联的蛋白复合体。作者团队以 SpyCatcher 蛋白为基石，通过在 SpyCatcher 中引入其他功能模块来实现次级功能，比如蛋白质的降解。具体而言，作者将 dTAG 系统中常用的降解标签连接至 SpyCatcher 蛋白上，然后通过添加 dTAG-13 等 PROTAC 小分子的方式引发 SpyTag-SpyCather 复合物的降解，最终实现靶点蛋白的清除。基于结构预测的结果，作者认为 HiBiT 模块与 SpyTag 模块间不需要额外的 linker 即可实现有功能的连接，实验结果也表明，省略 linker 不影响 HiBiT、SpyTag 的性能。落实到实验操作中，研究者需先使用 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑将 HiBiT-SpyTag 融合到靶点蛋白的 N 端或 C 端。值得注意的是，HiBiT 模块需保持在蛋白的最末端。融合表达靶点蛋白后，研究者需再次将带有 dTAG 标签的 SpyCatcher 蛋白以瞬转的方式引入宿主细胞中，并添加 dTAG-13 等小分子药物引发降解（图 2）。

图2.  HiBiT-SpyTag 标签的构成与实验流程

为验证 HiBiT-SpyTag 系统的性能，作者团队首先选择了成熟的 PROTAC 靶点，BRD4 蛋白，作为降解目标。在 HEK293T 细胞中，HiBiT-SpyTag 被融合到 BRD4 的 N 端，而 HiBiT-SpyTag 的降解量可通过生物发光信号来表征。在瞬转 dTAG-SpyCatcher 蛋白的 24 小时后，作者团队使用 dTAG13、dTAGv-1 小分子来引发 HiBiT-SpyTag-BRD4 的降解，并用先前报道的 BRD4 PROTAC 药物 dBET6 作为阳性对照。实验结果表明，HiBiT-SpyTag 可以在 5 小时的时间窗口内引发高效的目标蛋白降解，且该过程需要类泛素化过程的参与（图 3）。

图3. 使用 HiBiT-SpyTag 系统降解 BRD4 蛋白的结果

接着，作者将 HiBiT-SpyTag 系统应用到了内质网核信号转导蛋白 IRE1A 中。与 BRD4 不同，肽段标签被连接在了 IRE1A 蛋白的 C 端，因此 HiBiT 模块从肽段的上游被调换至下游。IRE1A 被认为与细胞的癌变相关。具体而言，当内质网中的蛋白质错误折叠响应（UPR）被激活时，IRE1A 将感知到内质网中的压力信号并激活其下游的 RNA 酶活性，激活 XBP1 蛋白的表达，以及 c-Myc 转录调节因子的上调。最终，该信号通路将维持细胞的生存，而其异常激活可在多种疾病中被发现。目前为止，IRE1A 尚未有临床可用的小分子抑制剂，因此开发一种降解 IRE1A 的 PROTAC 药物具有重要意义。实验结果表明，IRE1A-SpyTag-HiBiT 可在瞬转 dTAG-SpyCatcher与添加 dTAG13 药物后被高效降解。这验证了 IRE1A 作为 PROTAC 靶点的可行性（图 4）。

图4.  使用 HiBiT-SpyTag 系统降解 IRE1A 蛋白的结果

依照 IRE1A 的降解结果，作者团队开发了一种选择性降解 IRE1A 的 PROTAC 小分子药物。该药物结合 IRE1A 的能力由 RNA 酶抑制剂 MKC8866 及其变体 4µ8C 提供。再筛选了合适的 linker 与 E3 泛素连接酶结合分子后，作者团队构建了 CPD-2828 作为最终使用的 IRE1A 降解子。与此同时，作者也构建了 N-甲基戊二酰亚胺的变体 CPD-3121 作为阴性对照。作者使用 Rosetta 模拟了 PROTAC 分子与 IRE1A、CRBN的对接情况，结果表明，该药物分子可以引起 E3 泛素连接酶、靶点蛋白的邻近结合（图 5）。

图5. 针对 IRE1A 的 PROTAC 小分子设计

紧接着，作者同样使用 IRE1A-SpyTag-HiBiT 细胞系进行 CPD-2828 的降解性能验证。通过表征 HiBiT 模块生物发光信号的下调，作者确认了 CPD-2828 能够高效降解 IRE1A，而直接添加 MKC8866 反而会引起 IRE1A 蛋白的轻微上调，这是传统小分子抑制剂常会引起的负反馈调节现象。此外，作者也表征了 CPD-2828 与 E3 泛素连接酶的结合能力，结果表明，CPD-2828 可高效竞争 CRBN 荧光探针，这说明了 CPD-2828 与 CRBN 的直接互作。更进一步，作者研究了 CPD-2828 处理后的细胞的蛋白质组变化，结果表明，只有 IRE1A 蛋白的丰度出现显著变化，而其余蛋白的水平基本不受影响。这说明 CPD-2828 有良好的蛋白特异性（图 6）。

图6. IRE1A 选择性 PROTAC 分子的性能验证

综上，HiBiT-SpyTag 系统允许几乎无限的蛋白质组合，这可用于研究细胞中的蛋白质生物学和降解。通过向 dTAG-SpyCatche r添加蛋白定位标签，研究者可将构件的表达限制在选定的亚细胞区域内，用以选择性地去除特定区域中的蛋白。这使得 HiBiT-SpyTag 成为细胞中共价蛋白标签的多功能平台。例如，dTAG 技术已被证明可用于在细胞核、细胞质、高尔基体、内质网、过氧化物酶体、溶酶体和外线粒体膜中的蛋白降解。当 dTAG-SpyCatcher 上的定位标记与目标蛋白表达的定位相匹配时，也可以进一步提高标记效率和目标降解效率。这种方法还可以用于诱导除降解外的近距离作用，这可以通过替换 SpyCatcher 上的功能模块来实现。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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