英文原题：Aggregation Enhanced Photophysical Performance of D-π-A Structured Hemicyanine for NIR-II Fluorescent and Photoacoustic Imaging-guided Photothermal Therapy
通讯作者：蓝敏焕，中南大学化学化工学院，湖南省微纳米材料界面科学重点实验室；邓国伟，成都师范大学化学与生命科学学院，四川省功能分子结构优化与应用重点实验室。
作者：Baoling Li (李宝伶), E Pang (庞娥), Shaojing Zhao (赵少静), Shuodong Wang (王朔栋), Benhua Wang (王本花), Guowei Deng* (邓国伟), Jieyun Wu (吴杰云), Guangle Niu (牛广乐), Xiangzhi Song (宋相志), Minhuan Lan* (蓝敏焕)
背景介绍
高质量的成像对癌症的诊断和治疗有着巨大的应用前景。近红外（NIR）-II区荧光成像是一种光学成像方式，能够实现高图像分辨率和实时监测，但存在组织穿透能力低的问题。光声（PA）成像技术以超声波为载体获取组织的光吸收信息，从而避免了光学散射造成的穿透深度不足的问题，突破了传统光学成像的限制（约1 mm），实现了深部组织的PA成像，深度可达7 cm。但PA成像分辨率低于荧光。因此，NIR-II区荧光和PA成像结合的双模态成像技术可以实现更高效的组织成像。
光热疗法（PTT）因其高选择性、非侵入性和氧气不依赖性的特点而受到广泛关注。NIR-II区荧光和PA成像引导的PTT可以实现对肿瘤的精确诊断和治疗。理想的光热治疗试剂应该具有较强的NIR吸收/荧光发射和较高的光热转换效率（PCE）。金属基纳米结构由于其强烈的等离子体共振，通常在NIR区域表现出高的PCE。然而，明显的细胞毒性和无荧光限制了它们的临床应用。碳纳米结构比金属基纳米结构表现出更好的生物相容性，但却存在生物降解较难，吸收波长较短的问题。相比之下，有机光热剂，如香豆素、荧光素、萘甲酰亚胺、罗丹明和氰化物衍生物，由于其良好的生物降解性、可修饰的分子结构和可调整的光学特性，被广泛用于荧光传感、生物成像和医学治疗等方面。有机光热剂之一吲哚菁绿（ICG）已被美国食品和药物管理局批准用于癌症的临床成像和光疗。然而，这种受体-π-受体（A-π-A）结构分子的光稳定性差，PCE和荧光量子产率低，吸收和荧光波长短。
然而，具有供体-π-受体（D-π-A）结构的分子含有电子供体和受体基团，以及大的π-共轭结构，因而可以通过分子内电荷转移（ICT），使其吸收和荧光光谱发生红移。以D-π-A结构为特征的半花菁染料，由于具有摩尔吸收系数高、斯托克斯位移大、生物相容性好、易于分子修饰、吸收和荧光波长可调等优点，被广泛地应用于荧光成像和生物标记。因此，通过调整电子供体和受体基团或扩大π-共轭结构，可以设计和合成NIR荧光的半花菁衍生物。然而，开发具有强NIR-II区荧光和高PCE的新型半花菁染料仍然是不易的。
文章亮点
近日，中南大学蓝敏焕教授团队设计合成了一种具有D-π-A结构的半花菁染料M1 NPs聚集体，用于近红外II区荧光和光声成像引导下的光热治疗，并发表在 Chem. Biomed. Imaging上。这种D-π-A结构的半花菁染料M1。在分子设计策略具有以下优点：i）M1包含三个氰基作为电子受体，两个二乙基氨基作为电子供体，以及六个C=C键作为π-共轭系统。这种大的D-π-A结构的M1具有很强的ICT效应，表现出很强的近红外吸收和荧光，并且由于能隙定律而具有很高的PCE。ii) 具有强的拉电子基团，包括三个氰基和一个氯，可以有效地降低共轭结构中的电子密度，从而降低光氧化活性，并显著提高M1的光稳定性。环己烯和呋喃基团也增强了分子结构的刚性，进一步提高了M1的光稳定性；iii)环己烯上的叔丁基和呋喃上的两个甲基可以有效地阻止M1的π-π堆积，提高其荧光量子产率；iiii)两个N，N-二乙基氨基苯基团可以自由旋转，从而改善M1的非辐射转换，提高其PCE。
此外，单分子状态的M1相比，M1在水溶液中的聚集导致更好的光稳定性和更高的光热转换能力。聚集的M1可以隔离O2以减少激发态的氧化，从而导致比单分子更强的光稳定性。另一方面，聚集的M1的强分子间相互作用也促进了光热转换。因此，通过利用M1的聚集增强的光物理性能，用DSPE-PEG2000-NH2包裹疏水的M1，制备了水分散的NIR-II区荧光纳米粒子（M1 NPs）。M1 NPs表现出强烈的NIR I区吸收（734 nm）和NIR-II区荧光（1040 nm），具有306 nm的大斯托克斯位移。据测试，M1 NPs在水溶液中的荧光量子产率为2.84%，远远高于之前报道的NIR-II区荧光发色团，这使其具有出色的NIR-II区荧光成像能力。此外，M1 NPs表现出良好的生物相容性，良好的光稳定性，以及77.5%的高PCE，这些都优于临床使用的光诊疗剂ICG。体外实验结果显示，M1 NPs暴露在808 nm激光照射下产生的热量可以有效地抑制肿瘤细胞DNA的复制，并引发肿瘤细胞骨架的坍塌，从而诱导肿瘤细胞凋亡。基于其出色的PA和NIR-II荧光成像能力、高PCE、良好的生物相容性和光稳定性，M1 NPs被应用于PA和NIR-II荧光成像引导的PTT。
图1. (A) M1 的基态（左）和激发态（右）的HOMO-LUMO 分布。 归一化的吸收和荧光光谱(B) M1 (THF)和(C) M1 NPs。 (D) M1 NPs的扫描电镜照片。
使用密度函数理论（DFT）分析了M1的空间电子云分布。如图1A所示，HOMO的电子显示出非常相似的分布，主要是在基态（左）和激发态（右）的二乙氨基苯基单元上。相反，LUMO的电子显然在氰基取代的区域上是脱域的，这表明强烈的ICT。值得注意的是，分子构型，特别是二乙基氨基部分，显示出从基态到激发态的明显变化，导致M1的低的基态和激发态的能隙Eg和大的斯托克斯位移。Eg分别为1.88 eV和1.76 eV。
M1在THF中的吸收和荧光峰值分别为714 nm和1005 nm（图1B）。用DSPE-PEG2000-NH2包裹后，得到的水分散性M1 NPs显示出吸收和荧光光谱的红移，如图1C所示，其峰值分别在734和1040 nm。306纳米的大斯托克斯位移可能是由于聚集态中强烈的分子间D-A相互作用，进一步缩小了M1 NPs的Eg，M1 NPs在水溶液中的荧光量子产率为2.84%。图1D所示的扫描电镜图像表明，M1 NPs具有均匀的球形形状，平均尺寸为100 nm，这有利于细胞的吸收。此外，动态光散射数据表明M1 NPs具有良好的粒径稳定性。
图2. 时间依赖性的(A)不同激光功率和(B)不同浓度M1 NPs水溶液在激光辐照下的温度变化。(C)在808nm激光照射下(1W/cm2)，经过5次激光开/关循环后， M1 NPs水溶液、M1 NPs(DMSO)和ICG水溶液的温度变化。(D) M1 NPs浓度依赖的PA强度变化。
光热转换能力是光热材料的一个重要参数。从图2A和2B可以看出，M1 NPs水溶液的温度和激光功率及M1 NPs浓度是相关的。随着激光功率或M1 NPs浓度的升高，温度也随之升高。经过808 nm激光照射10分钟后，M1 NPs溶液的温度上升到64 ℃，计算出的M1 NPs的PCE为77.5%，这与金属基光热试剂相当。有趣的是，水溶液中的M1 NPs比DMSO中的M1表现出更好的光稳定性和光热转换能力。如图2C所示，经过五个循环的激光照射，M1 NPs水溶液的温度保持在60 ℃以上，M1的DMSO溶液的温度则保持在60 ℃以下，而ICG在经过几次光热循环后，温度明显降低，说明M1 NPs具有 比ICG有更好的光稳定性。由于其在近红外区域的高PCE和出色的光稳定性，M1 NPs表现出PA成像能力（图2D），并且PA强度与M1 NPs水溶液的浓度之间有很强的关联性。
图3. (A) M1 NPs浓度依赖性的细胞暗毒性和光毒性。不同处理后4T1细胞的（B）Calcein-AM/PI染色和（C）FITC标记的phalloidin染色的荧光成像。不同处理后的4T1细胞的(D）流式细胞术和（E）EdU染色荧光成像。
通过MTT实验研究了M1 NPs的细胞暗毒性和光毒性。在没有激光照射的情况下，即使M1 NPs的浓度增加到10 μM，4T1细胞的存活率仍在95%以上（图3A），表明M1 NPs具有良好的生物相容性。然而，暴露在1W/cm2的808nm激光照射下10分钟，随着M1 NPs浓度的增加，细胞活力明显下降，在M1 NPs浓度为10 μM时，细胞活力还不到5%，表明M1 NPs的高光毒性。通过钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）共染实验分析了M1 NPs对4T1细胞的光毒性。如图3B所示，只有M1 NPs+激光组的细胞发出红色荧光，而其他三组的细胞则表现出强烈的绿色荧光。F-肌动蛋白（F-actin）是细胞骨架的重要组成部分，与细胞运动和生长密切相关。F-actin可被鬼笔环肽特异性染色，通过监测FITC标记的鬼笔环肽的绿色荧光来分析形态学变化。在M1 NPs+激光组的4T1细胞中，F-actin几乎被破坏，而三个对照组则表现为刚性的丝状结构（图3C），说明M1 NPs在激光照射下有效破坏了F-actin，抑制了4T1细胞的生长和增殖。图3D的流式细胞术结果也证实，M1 NPs可以有效地促进照射后的4T1细胞凋亡。M1 NPs+激光组显示42.67%的早凋和55%的晚凋，而其他三组没有显示明显的凋亡，意味着细胞死亡是由M1 NPs引起的凋亡。随后，通过5-乙炔-2′-脱氧尿苷（EdU）染色评估M1 NPs对4T1肿瘤细胞DNA复制的抑制作用。如图3E所示，只有M1 NPs+激光组没有显示绿色荧光，表明M1 NPs在激光照射下对4T1细胞增殖有极好的抑制作用。
图4. 4T1荷瘤小鼠在808 nm激光照射照射下的（A）光声成像，（B）NIR-II区荧光成像和（C）时间依赖性的温度变化。不同治疗组小鼠的肿瘤体积（D）和体重（E）随时间的变化。(F）不同治疗组的肿瘤的H&E和Ki67染色的切片。
高分辨率的图像对于精确诊断和准确引导肿瘤治疗是非常理想的。利用M1 NPs的高PCE和NIR-II区荧光发射的优势，进行了体内PA和NIR-II区荧光成像。图4A和4B中分别清楚地观察到4T1肿瘤小鼠瘤内注射M1 NPs水溶液后，肿瘤区域的强烈PA和NIR-II区荧光。接下来，评估了M1 NPs的体内PTT疗效。肿瘤的温度由红外热成像仪记录。如图4C所示，M1 NPs+激光组的肿瘤温度在2分钟后迅速上升到50 ℃，之后维持在55 ℃左右。然而，生理盐水+激光组的温度只略有增加，表明M1 NPs在体内也表现出强大的光热转换能力。在接下来的14天里，对小鼠的肿瘤体积和体重进行了监测，以评估M1 NPs在体内的光热疗效。并且M1 NPs+激光组的肿瘤被完全消融，没有复发，而对照组的肿瘤体积则继续恶性增长（图4D）。此外，各组肿瘤小鼠的体重变化保持一致（图4E），进一步证明了M1 NPs的良好生物相容性。接下来，对不同治疗组的肿瘤进行剥离，用苏木精&伊红（H&E）和Ki67切片进行染色，以评估癌细胞的损伤和增殖情况。如图4F所示，只有M1 NPs+激光组的肿瘤切片显示细胞质间隙明显增加，表明PTT后肿瘤细胞损伤和增殖受到抑制。
总结/展望
综上所述，中南大学蓝敏焕教授研究团队制备了一种D-π-A结构的半花菁染料聚集体M1 NPs，证明了这种聚集体可以显著提高M1的光物理性能，包括更好的光稳定性和更高的光热转换能力。M1 NPs水溶液表现出强烈的近红外-I区吸收和近红外-II区荧光。M1 NPs能够通过良好的光热特性抑制肿瘤细胞的DNA复制并导致细胞骨架坍塌，诱导肿瘤细胞凋亡。基于这些优良的特性，证明了M1 NPs在PA和NIR-II区荧光成像引导下的肿瘤PTT中的应用。这项工作为设计具有NIR-II荧光和高PCE的光热剂提供了一些思考。
相关论文发表在高质量期刊Chemical & Biomedical Imaging上，中南大学硕士研究生李宝伶和庞娥为文章的共一作者，蓝敏焕教授为通讯作者。
通讯作者信息
蓝敏焕 教授
个人简介：蓝敏焕， 男，博士，中南大学化学化工学院特聘教授，博士生导师。
2007年于中央民族大学毕业，获理学学士学位，2013年于中国科学院理化技术研究所毕业，获理学博士学位，并获中国科学院院长优秀奖。2013-2017年在香港城市大学超金刚石与先进薄膜研究中心（COSDAF）担任高级研究助理。主要从事有机、无机发光材料的设计、合成及在生物/环境等领域的应用(主要包括荧光探针、生物成像、光诊疗及光催化)。在Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Adv. Mater., Nano Research, Chem. Commun. 等国际学术期刊发表研究论文80余篇，主持国家自然科学基金（青年、面上）、湖南省重点研发计划、深圳市科创委、中南大学创新驱动计划以及企业委托技术开发等项目10余项。
主页链接：
https://faculty.csu.edu.cn/lanminhuan/zh_CN/index/64935/list/index.htm
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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