ACS Chem. Biol. | 用于鉴定支链多泛素链reader和eraser蛋白的三泛素探针

英文原题：Triubiquitin Probes for Identification of Reader and Eraser Proteins of Branched Polyubiquitin Chains

供稿人：闪晔 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章，标题为“Triubiquitin Probes for Identification of Reader and Eraser Proteins of Branched Polyubiquitin Chains”，文章的通讯作者是来自美国特拉华大学化学与生物化学系的庄志豪教授。在这项工作中，作者开发了具K11-，K48-，K63键组合的不可切割的支链三泛素探针，用于鉴定识别支链三泛素结构的人源蛋白质，包括泛素结合蛋白和去泛素酶（DUB）。具体而言，作者使用半合成方法，生成了一类新的支链三泛素（triUb）探针，其中，利用不会被DUBs水解的硫醚键模拟了天然泛素链中的异肽键，同时在支链triUb的C末端引入含有炔基的弹头。这类探针不仅可以捕获通过非共价相互作用结合支链triUb结构的reader蛋白，还可以共价捕获一些可能原本无法紧密结合triUb被下拉鉴定的DUB。将K11/K48，K11/K63，K48/K63三种三泛素探针与HEK-293T细胞裂解液共孵育，下拉相应的reader和eraser蛋白进行质谱（MS）鉴定和蛋白质组学分析，从而研究支链三泛素结构可能参与的细胞过程和相应的作用。（图1）

泛素化作为一种关键的翻译后修饰，在蛋白质降解、DNA损伤反应、细胞周期进展和免疫反应等生物过程中扮演着重要的作用。泛素可以通过其自身的残基，包括七个赖氨酸残基和N-末端甲硫氨酸，进一步修饰，形成具有不同键、长度和拓扑结构的多泛素链。最近，人们发现支链泛素链在多种细胞过程中发挥重要作用，包括蛋白酶体降解、有丝分裂调节和NF-κB信号传导等过程。然而，对于reader和eraser蛋白如何识别和处理不同连接、不同拓扑结构的支链泛素链等问题，人们的理解还十分有限。因此，作者希望能开发支链多泛素链的探针，用于鉴定相应的reader、eraser蛋白，促进对支链泛素链修饰的理解。

首先，使用半合成的方法制备了支链triUb探针（图2）。通过重组表达得到HA标记的Ub1-75-MESNA，与接头分子（NCL）反应，随后羰基脱保护得到HA-Ub1-75-NC，其中。同时，将Ub1-75中用于产生泛素支链的选定的两个赖氨酸位点突变为两个半胱氨酸，得到相应的Ub1-75-MESNA与炔丙胺（PA）反应生成Ub1-75-PA。通过硫酯键偶联即可得到所需的支链triUb探针。其中，K11/K48，K11/K63，K48/K63三种triUb是通过使用含有三种半胱氨酸残基（K11C、K48C和K63C）中的任意两种的Ub1-75-PA反应得到的。

由于泛素C端的丙炔酰胺可以作为潜在的亲电试剂，与DUB的催化半胱氨酸巯基形成不可逆的共价加成产物，因此，支链triUb-PA探针可以用于共价捕获DUB的相互作用。作者用重组表达并纯化的DUB与探针共孵育，验证了支链triUb-PA探针可用于标记DUB，随后进一步评估了支化triUb-PA探针在HEK-293T细胞裂解物中对DUBs的标记（图3）。使用HA抗体的蛋白质印记分析显示，三种triUb-PA探针中均存在许多离散条带，观察到它们鉴定到一些共同的条带，也有各自独特的标记条带，且与相应的diUb-PA探针比较也具有显著的差异。

随后，作者使用支链triUb-PA探针在HEK-293T细胞裂解液中进行了下拉和蛋白质组学分析，鉴定通过非共价结合或基于炔基共价捕获的相互作用细胞蛋白（图4）。将探针与HEK-293T细胞裂解液共孵育后，使用抗HA此处进行下拉，用胰蛋白酶消化后，使用Orbitrap质谱仪对捕获的蛋白质进行nano-LC-MS/MS分析。使用MaxQuant处理蛋白质组学数据，随后用多样本方差分析（ANOVA）测试进行分析，对显著富集的蛋白质进行分组。如热图（图4A）所示，下拉蛋白聚集成12个单独的组，进一步进行基因本体（GO）分析（图4B），从而可以将每个簇的探针结合情况与相关的细胞成分或生物途径关联起来进行分析。

接下来，作者对下拉蛋白中含有泛素结合结构域（UBD）或催化核心的蛋白质进行了进一步的分析。他们发现鉴定到许多含有至少一种UBD的蛋白，许多泛素偶联机制相关的蛋白（图5A），以及许多可能识别泛素并被探针的PA弹头共价捕获的DUB（图5B）。作者观察到许多含有多个泛素相互作用基序（UIM）的蛋白被鉴定到，包括UIMC1/Rap80，AN13A和USP37，同一蛋白质中存在多个UIM可能有利于其与更复杂的支链泛素链结构相结合，作者对这些蛋白对支链种类结合的偏好性也进行了进一步的讨论，并利用生物层干涉技术对它们的支链泛素链亲和力进行了体外表征。

最后，作者详细地讨论了鉴定到的泛素结合蛋白参与的生物学过程，包括DNA损伤反应，蛋白酶体降解，线粒体自噬，受体内吞作用等，揭示支链泛素链可能对这些生物学途径具有重要的调控作用（图6）。

综上所述，作者开发了一类不可切割的支链三泛素探针，可用于鉴定识别支链三泛素结构的reader蛋白和eraser蛋白。对支链triUb富集的鉴定蛋白的组学分析指出了支链泛素链可能在一些细胞过程中存在作用，包括DNA损伤反应，自噬以及受体内吞过程等。这种新型支链三泛素探针的开发将有利于深入研究支链泛素链的识别机制及其在生物过程中的功能意义。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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