Wnt信号通路在胚胎发育、成体组织稳态维持以及多种人类疾病中发挥重要作用(1,2)。Wnt是一类具有糖基化和脂肪酸化修饰的分泌型蛋白分子，在哺乳动物体内有19个成员。Wnt与细胞膜上的FZD受体结合形成复合体，后者通过结合和激活不同类型的共受体，从而激活多条细胞内信号通路，大致分为经典通路（Wnt/b-catenin通路）和非经典通路（例如Wnt/PCP通路）。Wnt3a和Wnt5a是两个最有代表性的Wnt分子，其在细胞系中具有良好的分泌特性，因而研究的最多。Wnt3a与FZD和LRP5/6形成受体复合体激活b-catenin通路，主要控制细胞增殖和分化；Wnt5a与FZD和ROR1/2结合激活Wnt/PCP通路，主要调控细胞迁移和细胞极性。
Wnt信号受到多种细胞外调控分子的精细调控，以保障其正常行使功能。其中，Tiki是一类特殊的蛋白酶类Wnt抑制分子 (3-5)。Tiki作为细胞膜上的蛋白酶，通过水解Wnt蛋白的氨基端，从而抑制Wnt分子的活性。之前的研究报道，Tiki与Wnt3a共表达于细胞中导致Wnt3a氨基端被水解剪切，被剪切的Wnt3a蛋白能够正常分泌，但是在培养基中形成氧化多聚体，失去与FZD和LRP6受体结合的能力。另一方面，Tiki在接收Wnt信号的细胞中同样可以抑制Wnt信号，但是机制尚不清楚。除了经典通路，Tiki是否以及如何调控非经典通路也未见报道。
2023年3月30日，张新军课题组在国际学术期刊EMBO Reports 上在线发表了题为 “Frizzled receptors facilitate Tiki inhibition of Wnt signaling at the cell surface” 的研究论文 (6)。该研究阐明了Tiki蛋白在Wnt信号接收细胞的细胞膜上调控Wnt信号的机制，同时揭示了Wnt3a蛋白氨基端的重要功能。
Tiki与Wnt（例如Wnt3a）一起表达在细胞中时可以水解Wnt蛋白的氨基端。然而本文作者发现，分泌型的Tiki蛋白（TIKI2N）虽然在体外可以水解来源于Wnt3a蛋白氨基端的短肽底物，但是对Wnt3a蛋白却没有作用。另一方面，Tiki可以在接收Wnt3a信号的细胞膜上抑制Wnt3a信号。这些结果提示，Tiki很可能在细胞膜上存在辅助分子。作者首先采用生物素临近蛋白标记方法寻找Tiki在细胞膜上的相互作用蛋白（或者临近蛋白），意外发现了FZD2。由于FZD是Wnt配体的高亲和力受体，作者推测FZD很可能在细胞膜上辅助Tiki水解Wnt蛋白，从而抑制Wnt信号。
作者从以下四个方面验证了这一假设：1）Tiki在细胞膜上特异性水解FZD结合的Wnt3a和Wnt5a。Tiki与FZD共表达于细胞中可以水解FZD受体结合的Wnt3a或Wnt5a蛋白的氨基端，但是不影响Wnt-FZD受体复合体的稳定性；2）分泌型的Tiki（TIKI2N）蛋白在体外能够水解FZD-CRD结合的Wnt3a和Wnt5a；3）TIKI2N蛋白在体外与Wnt-FZD复合体结合；4）Tiki在Wnt信号接收细胞中抑制Wnt3a或Wnt5a诱导的LRP6或ROR1/2磷酸化，而对它们诱导的DVL2磷酸化没有作用，后者主要依赖于Wnt-FZD复合体。
图1. FZD在接收Wnt信号的细胞膜上协助Tiki水解Wnt3a和Wnt5a氨基端。
图2. FZD-CRD协助TIKI2N在体外水解Wnt3a和Wnt5a。注：TIKI2N水解Wnt导致Wnt蛋白的迁移加快；FZD1, 7-CRD协助TIKI2N水解Wnt3a；FZD1, 5, 7, 8-CRD协助TIKI2N水解Wnt5a。
图3. TIKI2N在体外与Wnt/FZD-CRD复合体结合。
图4. Tiki抑制Wnt3a或者Wnt5a诱导的共受体LRP6或者ROR1/2磷酸化。
Tiki在细胞膜上水解与FZD结合的Wnt蛋白的氨基端，阻止Wnt-FZD复合体对共受体LRP6或ROR1/2的激活作用。作者由此推测，Wnt蛋白的氨基端可能负责（或者参与）其与共受体的结合。并且，尽管不同Wnt蛋白的氨基酸序列同源性很高，但是它们的氨基端序列并不保守。因此，氨基端很可能决定Wnt与不同共受体的结合，从而决定Wnt信号的特异性（激活经典通路或者非经典通路）。作者首先对Wnt3a的氨基端进行研究。作者之前的研究发现Tiki与Wnt3a共表达于细胞中导致氨基端被水解的Wnt3a在培养基中形成氧化多聚体，后者不能结合FZD或者LRP6 (5)。然而，氧化多聚体的形成阻碍了对Wnt3a氨基端的直接研究。
本研究中，作者发现Tiki在细胞膜上或者在体外水解与FZD-CRD结合的Wnt3a并未导致后者形成氧化多聚体。作者推测，与FZD-CRD的结合对Wnt3a的构象可能具有保护作用。作者尝试在共表达TIKI2与Wnt3a的细胞中同时表达FZD7-CRD，结果发现FZD7-CRD果然能够与氨基端被TIKI2水解的Wnt3a形成复合体分泌到培养基中，且不形成氧化多聚体。由此，作者得到足够量的被TIKI2水解过的Wnt3a/FZD7-CRD CM，并可用于体外研究。结果表明氨基端被TIKI2水解的Wnt3a/FZD7-CRD与野生型Wnt3a/FZD7-CRD相比，不能够结合LRP6或者激活b-catenin通路。这些结果表明，Wnt3a的氨基端对于Wnt3a结合和激活共受体LRP6是必需的。有意思的是，近期斯坦福大学医学院Chris Garcia实验室在PNAS杂志发表研究论文报道了Xwnt8-FZD8-LRP6复合体的三维结构，显示Xwnt8通过氨基端和中部的linker结构域直接与LRP6结合，进一步证实Wnt蛋白的氨基端直接参与结合共受体LRP6 (7)。
图5. Wnt3a的氨基端是其结合共受体LRP6和激活b-catenin通路必需的。
图6. mFZD8-CRD/Xwnt8/LRP6复合体结构显示Xwnt8通过其氨基端和linker结构域与LRP6胞外区直接结合 (7) （图源：PNAS, 2023 Mar 14, doi: 10.1073/pnas.2218238120）。
接下来，作者对Wnt5a的氨基端进行研究。有意思的是，与Tiki共表达且氨基端被水解的Wnt5a分泌到培养基中并不形成氧化多聚体，并且仍然具有信号活性（能够诱导ROR1/2磷酸化），且其活性能够被TIKI2和TIKI2-H2A（酶活性失活突变体）抑制。这些结果表明，Wnt5a的氨基端不参与结合共受体ROR1/2，并且Tiki在接收Wnt5a信号的细胞膜上主要通过与Wnt5a-FZD复合体相互作用阻止其结合和激活共受体ROR1/2。
图7. Wnt5a氨基端（被Tiki水解）对于Wnt5a的活性没有作用，并且Tiki在接收Wnt5a信号的细胞膜上主要通过与Wnt/FZD复合体结合来抑制共受体ROR1/2的磷酸化。
总之，本研究揭示了FZD受体在接收Wnt信号的细胞膜上协助Tiki抑制Wnt通路的机制，发现Tiki通过不同机制抑制Wnt3a（经典通路）和Wnt5a（非经典通路）诱导的下游信号通路，同时首次报道了Wnt3a氨基端的重要功能，为进一步研究Tiki的功能和Wnt通路的调控机制打下了基础。
图8. Tiki在Wnt信号接收细胞的膜上调控Wnt信号的机制模式图。
张新军课题组博士生李明颐、郑静、罗栋为本文共同第一作者，张新军教授为通讯作者。哈佛医学院的贺熹教授和Bryan T MacDonald博士、东北大学的盛韧教授、以及华中科技大学同济医院的许凯教授参与了本研究。本研究得到国家自然科学基金面上项目、中央高校基础研究基金（华中科技大学）和四川省人民医院科研启动基金的支持。
论文链接：
https://www.embopress.org/doi/abs/10.15252/embr.202255873
1. Rim, E. Y., Clevers, H., and Nusse, R. (2022) The Wnt Pathway: From Signaling Mechanisms to Synthetic Modulators. Annu Rev Biochem 91, 571-598
2. Steinhart, Z., and Angers, S. (2018) Wnt signaling in development and tissue homeostasis. Development 145
3. Li, M., Zheng, J., He, X., and Zhang, X. (2022) Tiki proteins are glycosylphosphatidylinositol-anchored proteases. FEBS Lett
4. Zhang, X., MacDonald, B. T., Gao, H., Shamashkin, M., Coyle, A. J., Martinez, R. V., and He, X. (2016) Characterization of Tiki, a New Family of Wnt-specific Metalloproteases. J Biol Chem 291, 2435-2443
5. Zhang, X., Abreu, J. G., Yokota, C., MacDonald, B. T., Singh, S., Coburn, K. L., Cheong, S. M., Zhang, M. M., Ye, Q. Z., Hang, H. C., Steen, H., and He, X. (2012) Tiki1 is required for head formation via Wnt cleavage-oxidation and inactivation. Cell 149, 1565-1577
6. Li, M., Zheng, J., Luo, D., Xu, K., Sheng, R., MacDonald, B. T., He, X., and Zhang, X. (2023) Frizzled receptors facilitate Tiki inhibition of Wnt signaling at the cell surface. EMBO Rep, e55873
7. Tsutsumi, N., Hwang, S., Waghray, D., Hansen, S., Jude, K. M., Wang, N., Miao, Y., Glassman, C. R., Caveney, N. A., Janda, C. Y., Hannoush, R. N., and Garcia, K. C. (2023) Structure of the Wnt-Frizzled-LRP6 initiation complex reveals the basis for coreceptor discrimination. Proc Natl Acad Sci U S A 120, e2218238120
张新军教授长期从事Wnt通路相关研究，并且是Tiki基因的发现者，主要研究成果发表于Cell、Dev Cell、J Biol Chem、Autophagy、EMBO R 等生命科学主流期刊。课题组依托电子科技大学附属医院·四川省人民医院，拥有约300平米独立实验空间，科研经费充足，现面向海内外诚聘博士后，欢迎优秀的青年博士加入。详情参见：https://www.med.uestc.edu.cn/info/1064/4596.htm。
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