【学术笔记】人类心脏组织和多器官细胞模型的体外构建
记录人：张宗旭
2023年04月06日下午，受北大-清华生命科学联合中心、北京大学定量生物学中心曾泽贤研究员邀请，中科院遗传发育所分子系统生物学研究中心主任王秀杰研究员在生命科学学院邓祐才报告厅带来一场题为“人类心脏组织和多器官细胞模型的体外构建”的报告。
王秀杰教授做报告与交流
【概要】
王秀杰老师的实验室主要围绕三个方向展开研究：1.非编码RNA和RNA修饰调控；2.生物信息学分析和工具开发；3.3D生物打印和器官形成机制。在本次报告中，王秀杰老师就m6A修饰调控长期记忆形成效率的机制、基于余弦距离的单细胞组学标记基因识别、3D生物打印和体外构建多器官模型三个方面与老师和同学们展开了交流。
【精彩回顾】
m6A修饰增强长时记忆形成效率
在编码和非编码RNA中，人们已经发现了超过170种RNA修饰。N6-腺苷酸甲基化（m6A）修饰是真核生物mRNA上最普遍和丰富的转录后RNA修饰，主要由METTL3/METTL14/WTAP复合物催化形成，其中METTL3是催化m6A形成的关键甲基转移酶。转录本上的m6A修饰的存在有助于细胞基本功能的行使，如m6A调节外显子包含和3’端处理、替代剪接、核输出、翻译和降解、m6A调控miRNA的加工，m6A调控circRNA的翻译等1。
图1：m6A修饰具有不同的功能1
长时记忆的形成（Long-term memory formation）是哺乳动物适应环境变化、智力发展所必需的，大脑的海马体是人类形成长记忆的主要物质载体2。尽管已有多项研究表明m6A是哺乳动物胚胎发育和多种组织器官形成所必须的，并且参与肿瘤发生等多种重要生物过程调控，但尚不明确m6A是否参与了记忆形成调控。
为此，王秀杰组张泽宇同学使用CaMKIIα-Cre特异性地在乳鼠的皮层及海马区中敲除Mettl3，与Nestin-Cre介导的METTL3/METTL14敲除小鼠的致死表型不同，此类敲除小鼠成体具有正常体重、生育能力及大脑结构。行为上，敲除小鼠具有正常的运动能力、探索能力、趋触性、焦虑水平甚至短时记忆能力。使用Morris水迷宫和条件化恐惧反应实验发现，Mettl3 cKO小鼠的长期记忆巩固过程较对照组有显著延长。
图2：海马区Mettl3的缺失延长了长时记忆的巩固过程
进一步地，使用突变-回补实验，他们证明了长时记忆的巩固取决于METTL3的m6A甲基转移酶活性。具体来说，在海马区注射Mettl3后的Mettl3 cKO小鼠长时记忆的形成能力与对照组基本相同，但是注射甲基转移酶活性位点突变后的Mettl3组小鼠并未恢复。
图3：在海马区回补Mettl3恢复了小鼠的长时记忆的巩固过程
在过表达Mettl3的小鼠中，研究人员观测到了长时记忆形成增强的现象。综上，m6A水平正向调控了小鼠的空间学习能力，缺失或增加m6A修饰（敲除或过表达METTL3）的小鼠分别表现出明显的学习能力下降或上升。
图4：过表达Mettl3的小鼠的长时记忆形成能力增强
长时记忆形成同时依赖于基因的转录与新蛋白的合成，其中一类基因能够在很短时间内响应外界环境刺激并进行特异性的表达翻译，故被称为早期响应基因（Immediate-early genes）3，在m6A缺失的小鼠海马体中，虽然早期基因能够被正常诱导表达，其产生的蛋白丰度要显著低于对照小鼠；进一步分析表明，在诱导兴奋的神经元中，m6A修饰丰度正向调控了早期响应基因的蛋白丰度，提示m6A修饰通过提高早期响应基因的翻译效率来调控小鼠学习速度。
图5：m6A修饰通过提高早期响应基因的翻译效率来调控小鼠学习速度
实验过程中发现，对于Mettl3 cKO小鼠，如果给予足够的训练，这种由m6A丰度决定的学习能力差异并不影响小鼠的最终学习结果：尽管在训练初期存在差异，但经过5天水迷宫训练或三次足部电击后，m6A缺失或增加的小鼠与各自对照相比都呈现了相似的学习水平，说明通过METTL3调节m6A丰度可以影响小鼠学习速度的快慢，却并不能决定最终小鼠长时记忆是否形成。这正对应了“勤能补拙”的现象，该工作以封面文章的形式发表在Cell Research上4。
图7：m6A修饰增强长时记忆形成效率
COSG可以准确快速的鉴定单细胞组学标记基因
接下来王秀杰老师介绍了基于余弦相似度的COSG算法以识别单细胞组学数据中的标记基因（Marker gene）。细胞标记基因的准确鉴定是进行单细胞数据下游分析的基础，但是目前统计学鉴定标记基因的方法所识别的标记基因可能会受基因表达偏向性的影响导致所识别的标记基因非真实基因5。此外随着高通量单细胞测序数据的涌现，每次实验捕获的细胞数量大大增加，现有算法存在运算速度慢的问题。为此，王秀杰老师团队开发了COSG算法，与基于统计学的方法相比，该算法可以更加准确地识别不同细胞种类的标记基因，且具有良好的计算效率和可拓展性，对于单细胞ATAC-seq数据和空间转录组数据等不同模态的数据的标记基因的鉴定均优于现有其他方法。
图8：COSG基于余弦距离识别细胞组中的标记基因6
使用3D生物打印制造心机组织
王秀杰老师接下来介绍了3D生物打印方面的工作。在我国，功能衰竭或肿瘤导致的器官移植需求迫切，我国器官需求与供给比大于150：1。使用3D打印体外产生器官是一种潜在的解决方式。但是，传统3D打印方式制造的器官面临存活与功能问题7，难以突破血管与细胞融合的瓶颈8：无法形成血管网络保障细胞存活。为此，王秀杰老师团队与合作者一起开发了一种六轴机器人3D生物打印技术，并建立了油面下打印细胞的体系9。
六轴机器人打印机的每一个轴都可以进行360°转动，故理论上可以在空间中实现任何角度的细胞打印。研究人员首先基于六轴机器人开发了高精度的操纵算法，实现了空间中的打印轨迹的精确控制和空间中任意角度的细胞打印。
图9：六轴机器人生物打印系统可以实现打印轨迹的精确控制和空间中任意角度的细胞打印
为了避免生物固化材料对细胞活性的影响，研究团队使用矿物油建立了油面下打印细胞的体系。使用该生物打印系统打印后的细胞可以维持99%的存活率，利用TUNEL染色标记断裂DNA片段的方法对细胞损伤与凋亡情况进行检测，发现打印过程中不会造成细胞的DNA损伤，针对血管内皮细胞形成管状分支能力检测、心肌细胞形成Gap junction能力检测表明打印过程中不会影响细胞功能。
图10：打印后的细胞具有活性并能行使相应功能
为了解决传统3D打印方式制造的器官面临的存活与功能问题，王秀杰老师团队模拟发育过程中组织器官体积增大和内部毛细血管生长协同的规律，设计了循环式打印-培养的器官制造方案，并建立了高效的人类心肌细胞分化体系。最终，使用这一方案能够在血管支架上制备完整的内皮细胞层，并在血管生长因子的辅助下生长出新血管和毛细血管网络，从而支持打印组织或器官的长期存活。
图11：打印后的内皮细胞形成微血管网络
此外，使用机械手臂打印的心肌组织具有搏动能力，且具有单一起搏点。利用该体系打印的人胚胎干细胞可分化形成心肌与血管网络。这一全新打印体系建立在多学科交叉与合作的基础上，突破了传统技术的局限，为复杂器官的体外制造提供了一种更加可行的解决方案。
huMO是首个自然发育的人类多器官整合模型
最后，王秀杰老师针对现有动物模型和人类类器官模型存在的较多瓶颈问题10，构建了huMO模型，单细胞测序分析发现huMO同时包含三胚层分化的细胞且包含多个器官系统的主要前体细胞。进一步分析发现huMO中不同器官细胞的发育程度具有同步性，其中心脏组织的搏动和功能成熟依赖于其他组织。
总之，huMO是全新的研究模型，可以帮助我们更加深入理解人类特有的各类生命过程。
转自：“生命科学联合中心”微信公众号
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