枯草芽孢杆菌呋喃醛还原酶YugJ的结构和生化分析

1、文献题目

Structural and Biochemical Analysis of the Furan Aldehyde Reductase YugJ from Bacillus subtilis

文献期刊：Int. J. Mol. Sci.

10.3390/ijms23031882

2、文献提出的科学问题

由于其解毒活性，呋喃醛还原AAOR可以应用于生物燃料工业，通过木质纤维素生物质的微生物发酵获得乙醇的预处理阶段会产生不良的有毒副产品，抑制乙醇细菌的生长，降低乙醇产量。由于呋喃醛是最有毒的副产品，因此需要采取消除呋喃醛的策略，如AAOR介导的呋喃醛还原，以提高乙醇产量。

3、研究总体方案

来自枯草芽孢杆菌的YugJ是一种非典型的NADPH依赖性第三组AAOR，其在存在Ni2+辅因子的情况下还原呋喃醛。此外，我们的抑制试验和分子对接分析表明，YugJ与HMF底物在NADPH和Ni2+附近的结构域间裂缝中相互作用。

4、主要研究成果

1、作为研究YugJ催化特性的第一步，我们分析了YugJ的底物特异性。在NADPH作为还原辅因子的存在下，使用一系列醛作为推定的底物来测定重组YugJ蛋白的还原酶活性。YugJ对HMF表现出最高的还原酶活性，其中醛基连接到羟甲基化的呋喃环上(图1a)。YugJ对糠醛也有催化活性，但活性低于HMF。虽然YugJ积极催化HMF还原，但YugJ并不驱动逆反应。在存在NADP的情况下，2，5-双(羟甲基)呋喃(HMF的一种酒精对应物)基本上没有检测到酶活性(补充图S1)。这些观察表明YugJ作为呋喃醛还原酶而不是醇脱氢酶起作用。除了其对环状醛的活性之外，YugJ还减少了线性醛。在丁醛、丙醛和乙醛中，YugJ显示出丁醛(一种线性四碳醛)的最高活性，与HMF的水平相当，与丁醛相比，异丁醛(一种支链四碳醛)的活性较低。为了进一步探索YugJ的酶学性质，在pH 6.0-9.5的范围内检测了YugJ的pH依赖性。由于NADPH的不稳定性和YugJ在低PH下不能结合金属，因此无法解决YugJ在pH值低于6.0时的催化活性。YugJ在pH 6.0-7.0比在碱性pH值表现出更高的HMF还原活性。YugJ还表现出金属依赖性，当pH值为5.0的EDTA对YugJ蛋白进行脱金属处理时，无金属的YugJ蛋白在pH值为7.4时没有还原HMF。当补充二价金属离子时，YugJ还原HMF。Ni2+和Co2+的催化活性最高，其次是Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+和Cu2+。Ni2+和Co2+离子表现出相似的配位特性，并且许多Ni2+配位蛋白可以使用Co2+作为替代的金属辅因子。为了评价YugJ的温度依赖性，在不同温度下测量HMF还原活性，YugJ的HMF还原活性在16-44℃之间随着温度的升高而逐渐增加，在44℃以上迅速降低，在58°c时观察到可忽略的活性。(YugJ的动力学参数是通过将Michaelis–Menten模型拟合到YugJ的催化活性而获得的，YugJ的催化活性是在NADPH和Ni2+存在下在PH 7.4(对应于枯草芽孢杆菌胞质溶胶的pH值)下用宽范围的HMF浓度获得的)

2、为了获得对YugJ介导的醛还原的结构见解，我们通过分子置换法在空间群P212121中以2.15 Å的分辨率测定了YugJ与Ni2+离子（YugJNi）复合的晶体结构。YugJ晶体的不对称单元包含两条YugJ多肽链（链A和链B），它们被排列成一个同源二聚体。这样的二聚体在溶液中也被检测到。在凝胶过滤色谱中，YugJ蛋白（单体的计算分子量，43.3 kDa）被洗脱为44和158 kDa蛋白标准之间的二聚体（表观分子量，~74 kDa）。YugJNi由两个结构域组成，一个N端结构域（NTD；残基1-183）和一个C端结构域（CTD）。NTD包含一个类似于Rossmann的α/β折叠，其中一个六股平行的β片（β1-β8-β5-β4-β2-β3）位于中心位置，被六个α片包围。类似于Rossmann折叠的一个面也被从β5和β8股中突出的β6 -β7发夹所装饰。β1链是由11个残基组成的最延伸的β链，与来自正面亚单位的对应的β链反平行排列，使YugJ形成一个12链的 β-片和二聚体。与NTD相反，CTD仅由α螺旋组成，并可分为两个α螺旋束(α7-α9螺旋和α10-α15螺旋)。NTD和CTD组成一个裂缝，容纳NADP(H)辅因子。YugJ显示了与其他III组AAORs的结构相似性，包括大肠杆菌YqhD (PDB ID 1OJ7)、肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脱氢酶(PDB ID 3BFJ)和运动发酵单胞菌醇脱氢酶2 (PDB ID 3OWO)。这些ⅲ类AAORs与YugJ具有显著的序列(序列相同，27%~37%)和结构(均方根偏差，1.7~2.3 Å)相似性，表明YugJ为ⅲ类AAOR。与III族AAORs的整体结构相似相反，α9 -α10环的局部结构根据长度分为两种构象。大多数III族AAORs的α9 -α10环较短，并在α9和α10螺旋之间紧密旋转。而YugJ的α9 -α10环较长，与大肠杆菌YqhD相似，采用了更为延伸的线圈结构。有趣的是，YugJ α9 -α10环的这种独特结构参与了活性位点的调控。在YugJNi结构中，在每个YugJ单体中发现属于金属离子的强电子密度峰，尽管金属离子没有用于结晶。为了确定金属离子的特性，从YugJ晶体获得X射线荧光光谱，在7.46 keV处观察到主峰，其对应于Ni2+离子的X射线发射能量，表明在YugJ结构中观察到的金属离子是Ni2+离子。Ni2+离子位于结构域间裂隙中CTD的两个α-螺旋束之间，由保守的天冬氨酸(Asp194)和组氨酸(His198、His267和His281)残基协调。因YugJ在Ni2+离子存在下表现出高醛还原酶活性，并且在YugJNi的晶体结构中观察到Ni2+离子，我们得出结论，YugJ是一种非典型的III族AAOR，Ni2+离子作为金属辅因子。

3、第三组AAR使用NADPH或NADH作为催化作用的还原辅因子。为了确定YugJ的辅因子特异性，在NADPH或NADH存在下测量YugJ的HMF还原活性。当补充NADPH时，YugJ作为HMF还原酶具有高活性，但它对NADH没有活性，表明YugJ是一种NADPH依赖性醛还原酶。为了解决YugJ与NADP(H)的特定相互作用，我们确定了YugJ与NADP以两种晶体形式复合的晶体结构。第一个晶体结构(P1空间群)包含NADP辅因子和Ni2+离子，并被命名为YugJNADP-Ni。第二个NADP结合结构(空间群P21)在NADP附近额外含有硝酸根离子，并被命名为YugJNADP-NO3。对于NADP的每个原子，YugJNADP-NO3结构表现出明确的电子密度。但在YugJNADP-Ni结构中，NADP的烟酰胺环是无序的，只构建了剩余的NADP区域。在YugJNADP-NO3结构中，NADP分子深深嵌入YugJ的两个结构域之间的缝隙中。NADP倾向于结构域间裂缝中的NTD，并且表现出与NTD的相互作用多于与CTD的相互作用。来自二聚体的每个YugJ多肽链主要通过氢键和范德华相互作用结合一个掩埋表面积约为690平方英尺的NADP分子。NADP的腺嘌呤部分夹在Ser41和Val183残基之间，与β5–β6环(Thr138)和β8–α7环的YugJ残基形成氢键。NADP中的烟酰胺环及其连接的核糖部分也与YugJ残基形成多个氢键。β3–α4环和β7链上的YugJ Asn71和Lys160残基分别与NADP核糖部分的羟基相互作用。在YugJNADP-NO3结构中，烟酰胺环分别与来自α5螺旋、β5–β6环和β6链的YugJ Asp102、Asn147和Gly149残基相互作用。然而，在YugJNADP-Ni结构中，由于烟酰胺紊乱，没有观察到烟酰胺-YugJ相互作用。NADP(H)有一个NAD(H)中没有的额外的磷酸基团。在YugJNADP-NO3结构中，NADP的20-磷酸基团被插入第二个GGGS基序(GGGS2基序；Gly38-Ser41残基)。GGGS2基序利用Gly39-Ser41主链和Ser41侧链与NADP的20-磷酸基团广泛相互作用。GGGS2基序在依赖NADP(H)的第三组AAOR酶中高度保守(补充图S3中的YqhD)[12]。然而，在依赖NAD(H)的第三组AAOR酶中，GGGS2基序处的Gly38残基被天冬氨酸残基取代，这与NADP(H)的20-磷酸基团发生空间冲突。因而我们可知YugJ保留的GGGS2基序在区分NADP(H)和NAD(H)中起关键作用。

4、为了进一步研究YugJ的底物结合机制，我们通过计算机分子对接模拟了HMF结合的YugJ结构。在复杂模型中，HMF位于结构域间隙中NADP烟酰胺部分附近，HMF的醛基朝向烟酰胺环的C-4原子和Ni2+离子。值得注意的是，HMF的醛基与覆盖YugJNADP-NO3结构中的硝酸盐离子发生立体冲突。在YugJ-HMF模型中，YugJ残基与HMF末端(醛基和羟基)相结合并稳定，使HMF定向还原。CTD α10螺旋结构的His271残基与HMF的醛基形成氢键。在先前对大肠杆菌YugJ同源物的突变研究中，已经报道了His271对底物结合的贡献。来自NTD β6和β7链的Ser150和Trp163残基分别直接与HMF的羟基相互作用，这解释了为什么缺乏羟基的糠醛被YugJ还原的效率低于HMF。

5、基于结构和生化研究，我们鉴定枯草芽孢杆菌YugJ为NADPH依赖性呋喃醛还原酶。对YugJ结构的比较分析使我们能够提出在YugJ介导的HMF还原过程中发生的初步催化过程。NADPH被插入到YugJ的结构域间裂缝中，将YugJ的结构域间动力学限制为封闭的构象。接下来，HMF底物结合NADPH和金属辅因子附近的活性位点，并通过α9–α10环盖的闭合而稳定，用于产物的形成。

5、作者给出结论

1、基于结构和生化研究，我们鉴定枯草芽孢杆菌YugJ为NADPH依赖性呋喃醛还原酶。

2、对YugJ结构的比较分析使我们能够提出在YugJ介导的HMF还原过程中发生的初步催化过程。NADPH被插入到YugJ的结构域间裂缝中，将YugJ的结构域间动力学限制为封闭的构象。接下来，HMF底物结合NADPH和金属辅因子附近的活性位点，并通过α9–α10环盖的闭合而稳定，用于产物的形成。

转自：“科研一席话”微信公众号

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