1、文献题目
Regulating the N Coordination Environment of Co Single-Atom Nanozymes for Highly Efficient Oxidase Mimics
文献期刊：Nano Lett.
10.1021/acs.nanolett.2c04944
2、文献作者
梁敏敏，北京理工大学材料学院教授。主要从事仿生纳米材料的生物工程化制备及其生物医学应用方面的研究。（1）首次报道了人铁蛋白天然识别肿瘤的新特性，阐明了铁蛋白由受体TfR1介导的肿瘤识别机制，并在大量临床样本上验证了铁蛋白的肿瘤识别特异性，体现了铁蛋白的重大临床应用价值。（2）研制出具有重大临床应用前景的仿生纳米材料，实现了仿生纳米铁蛋白的生物工程化规模制备，建立了g 级生产工艺，制定了相应质控标准；（3）利用仿生纳米铁蛋白的生物相容性及肿瘤靶向性，将抗癌药物高剂量装载于铁蛋白纳米空腔内，制备了铁蛋白纳米药物靶向递送系统，实现了抗癌药物的高效体内靶向输送，仅单次给药就有效抑制了肿瘤成长；（4）发现仿生铁蛋白的癌细胞高效转运通路，能够将信号分子高浓度富集于肿瘤细胞，克服了核医学与磁共振两种成像方式在灵敏度上存在的巨大差异（灵敏度相差107倍），实现了体内癌灶最高分辨率的形态学成像（磁共振）及最佳灵敏度的功能成像（核医学）；（5）开发了基于仿生纳米铁蛋白的肿瘤病理诊断试剂盒，相关专利获得国内及美欧日授权，专利实现成果转让，并于2018年获两项医疗器械注册证书。
逯一中，济南大学，教授，博导，学术带头人，材料物理与化学系副主任。研究方向包括（1）金属纳米团簇的合成、表征和电催化应用；（2）贵金属纳米结构材料的设计和合成及其在燃料电池中的应用；（3）二氧化碳电催化还原；（4）构建新型、高效的生物传感器；（5）单原子/二维纳米结构材料的复合物在催化反应中的应用。
3、文献提出的科学问题
具有明确的原子结构和精确调控的配位环境的单原子催化剂已被认为是天然金属酶的潜在替代品。虽然已经发现了各种单原子Co纳米酶，但其对催化效率的配位效应及其潜在的催化机制尚未见报道。
4、分解为几个研究目标
1、合成了一系列具有不同氮配位数的Co单原子催化剂(Co - nx (C)， x = 2,3,4)，并证明了通过微调N配位数可以有效地调节Co单原子催化剂的类氧化酶活性。
2、以TMB氧化为典型的催化反应，研究了Co - Nx(C)-SAzymes的氧化酶样活性。
3、使用联合密度泛函理论(DFT)计算和酶活性分析实验证明了单原子Co纳米酶的N配位与氧化酶样活性之间的调制关系。
5、研究总体方案
合成了一系列具有不同氮配位数的Co单原子催化剂(Co - nx (C)， x = 2,3,4)，并证明了通过微调N配位数可以有效地调节Co单原子催化剂的类氧化酶活性。在研究的单原子Co催化剂中，具有三配位N原子的Co - n3 (C)表现出最佳的氧吸附结构和稳定的活性氧(ROS)生成，从而表现出较好的氧化酶样催化活性。
6、主要研究成果
1、考虑到配位环境是决定单原子Co纳米酶类氧化酶性能的关键参数，我们首先进行了密度泛函理论(DFT)计算，以筛选出最合适的结构作为高效氧化酶模拟物。基于普遍存在的CoN4部分，考虑了二维石墨烯结构中单原子Co的几种可能模型(不同配位数的Co−C3、Co−C4、Co−N2(C)、Co−N3(C)和Co−N4(C))。O2分子的吸附能(Eads)可作为评价可能的氧化酶模拟物的氧化酶样活性的可靠描述符。考虑到底物模型中Co原子对O2分子的吸附在吸附构型上通常呈单侧或单侧分布(图S4, S5)，计算了不同配位N原子的所有势结构的Eads值。在最佳吸附构型下，Co−N3(C)模型对O2的化学反应活性最高，Eads值为−3.088 eV，因此被认为是一种有吸引力的氧化酶模拟物。根据计算结果，我们得出单原子Co纳米酶的氧化酶样活性在很大程度上取决于它们的N原子配位数。
2、根据理论计算的预测，通过调节Co/Zn ZIFs的不同热解温度，制备了不同N配位数的单原子Co催化剂。制备的Co Nx(C)-SAzymes保留了最初的菱形十二面体形状，没有形成大尺寸的纳米颗粒或团簇。EDX图显示，Co、N和C元素均匀分布在整个结构中。像差校正HAADF-STEM分析显示，许多明显的孤立亮点(用橙色圆圈突出显示)分布在碳基体上，表明Co单原子的存在。ICP-MS结果显示所有样品的Co质量负载为1.15-1.20 wt %。
3、XRD图显示所有三种Co Nx(C)-SAzymes都没有结晶Co的特征峰，表明没有明显的Co颗粒聚集。BET测试和相关的孔径分布表明，所有三种构型都具有多孔结构和大表面积，这有利于活性Co位点的暴露。XPS分析表明，随着温度的升高，氮含量逐渐降低，在所有三种构型的N 1s光谱部分中均可观察到Co-N键的存在。一对非零价Co的特征峰的存在表明Co Nx(C)-SAzymes中的钴处于氧化态，进一步证实了其孤立的配位构象。重要的是，Co 2p的结合能逐渐向更低的方向移动，表明Co-N配位数逐渐降低。Co K边XANES光谱的边能位于CoO和Co3O4之间，表明这三种Co单原子催化剂中的Co原子处于Co(II)和Co(III)之间。随着热解温度的升高，Co-N配位数降低，边缘向能量较低的方向移动，表明Co中心的氧化态还原与温度有关。这种偏移与Co 2p XPS测量中结合能的降低相一致。定量EXAFS分析进一步研究了Co原子的配位构型。发现三种催化剂的所有Co原子在1.4Å处有明显的Co-N配位峰，没有典型的Co-Co峰存在。Co−N4(C)的Co−N峰值强度显著高于Co−N3(C)和Co−N2(C)，表明Co中心协同的N量逐渐增加。这与XPS分析试验中N含量的变化相一致。拟合结果表明，Co−N2(C)、Co−N3(C)和Co−N4(C)催化剂中Co−N的比配位数分别为2.1、3.2和4.3。结果表明以Co−Nx(C)模型为初始结构的EXAFS接头与实验结果一致，R因子小于0.02，验证了所述模型的合理性。为了进一步区分Co的配位环境，使用小波变换(WT)分析作为FT分析的补充。三种催化剂的WT等高线图只有一个在6 Å−1左右对应于Co−N配位的最大强度值，并且没有观察到与Co−Co信号相关的最大强度值。因此，上述结果表明所制备的Co - Nx(C)-SAzymes具有原子分散的Co活性位点和明确的配位环境。
4、以TMB氧化为典型的催化反应，研究了Co - Nx(C)-SAzymes的氧化酶样活性。Co−Nx(C)-SAzymes具有催化模型反应的活性，并生成强烈的蓝色反应溶液(oxTMB)，其特征吸收峰位于652 nm。通过氧化另外两种典型的氧化酶底物，2,2 ' -氮氮基-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(ABTS)和邻苯二胺(OPD)，进一步证实了氧化酶样活性。Co - Nx(C)-Sazymes。在较宽的pH(2.8 - 4.4)和温度(10 - 40℃)范围内显示出较高的氧化酶样活性，表明具有广泛的实际应用。Co Nx(C)-SAzymes的催化活性在N2引入的条件下被显著抑制，但在O2引入的条件下显著增加，这证实了Co Nx(C)SAzymes的O2依赖性氧化酶样催化氧化。为了进一步量化Co-Nx(C)-SAzyme的催化效率，我们测试了TMB Co-Nx(C)反应系统的吸光度强度，结果表明Co-N3(C)SAzyme表现出最佳的氧化酶样活性。动力学常数和比活度计算表明，N3(C)具有最大的Vmax、最小的Km和最高的比活度值。结果表明与以前报道的大多数单原子纳米酶相比，N3具有更高的类酶活性。所有上述对比实验表明，N3(C)具有最佳的氧化酶样活性，这与从前面的理论计算筛选中获得的结论一致。为了进一步探索类Co Nx(C)氧化酶活性的反应中间体，我们测量了催化过程中产生的自由基。只有当对苯二甲酸(TA)和Co-NX(C)共存时，反应体系才产生清晰的荧光特征峰，表明羟基自由基(·OH)是反应过程中关键的催化中间体。接下来我们将相应的自由基清除剂添加到TMB-Co-Nx(C)体系中，当分别加入对苯醌、过氧化氢酶和色氨酸时，系统的吸光度没有显著下降，表明Co-Nx(C)催化的O2分解产物不含O2·-、H2O2或1 O2。当自由基捕获剂DMPO与Co-Nx(C)的水溶液共存时，在EPR光谱上出现明显的特征峰，其强度比为约1:2:2:1，对应于·OH。
5、为了进一步研究Co Nx(C)-SAzymes对氧化酶样催化效率的协同作用，我们使用荧光实验定量表征了·OH产生的速率。由于非荧光香豆素(COU)分子可以与·OH反应，形成高度荧光的7-羟基香豆素(7 HC)，在456 nm处具有明显的荧光特征峰，因此我们通过测量乙酸盐缓冲溶液(pH = 3.6)中不同浓度的标准化合物7 HC的光致发光强度，定量分析了在COU存在下由conx(C)产生的7 HC(或·OH)的浓度。建立了7 HC的标准曲线，得到了7 HC浓度与光致发光强度的线性关系。让Co-Nx(C)与定量的COU反应产成7HC，并记录溶液的光致发光强度值，通过将每个光致发光强度值代入7 HC的标准曲线，得到Co-Nx(C)产生的-OH浓度与时间的线性关系。从线性关系的斜率得到的Co-N2(C)、Co-N3(C)和Co-N4(C)的·OH产生率分别为1.08 × 10-3 μM s -1、3.41 × 10-3 μM s -1和2.51 × 10-3 μM s -1。结果显示，Co-N3(C)产生·OH的速度最快，这与理论计算结果一致，即Co-N3(C)结构最容易产生·OH。为了了解单原子Co纳米酶的氧化酶样催化活性的来源，我们优化了反应路径，并计算了三种催化剂中每一种的沿最佳反应路径的自由能变化。Co-N2(C)、Co-N3(C)和Co-N4(C)从溶解氧（i）到·OH（vi）反应的自由能变化值分别为-2.45 eV、-3.91 eV和-2.59 eV。结果表明，Co-N3(C)比其他两种催化剂更容易生成·OH。这与图中氧化酶样活性的比较结果和图中得到的-OH生成率的计算结果一致。因此，氧在Co单原子活性部位的吸附和随后的裂解中共同发挥了决定性作用。
6、作为天然酶的模拟物，纳米酶因其低成本、良好的稳定性和耐久性而被广泛用于生物传感领域。由于Co-Nx(C)出色的氧化酶活性，它可以将无色的TMB氧化成蓝色的氧化TMB（oxTMB），而当一些还原性的小分子如抗坏血酸（AA）、谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）或多巴胺（DA）被引入到反应系统时，oxTMB可以被还原。我们试图通过比较Co-Nx(C)在相同条件下消耗这些还原性物质以及生物酶的能力来比较它们的氧化酶样活性。当上述物质分别进入系统后，溶液吸光度明显下降，基于Co-Nx(C)-TMB的比色传感系统可以检测这些还原性物质和生物酶，并且可以得到待测物质的浓度/活性与吸光度之间的线性关系。通过以上得到的线性关系，我们可以找到Co-Nx(C)对四种还原物质以及三种生物酶的 "消耗"。通过比较消耗量，我们可以看到Co-N3(C)对每种物质都有最高值，这再次证实Co-N3(C)具有最佳的氧化酶样活性。这种通过比较 "消耗 "来比较酶类活动的方法是一种通用策略，可以扩展到其他能够产生还原物质的酶。
7、作者给出结论
1、研究了N原子的配位数对单原子Co催化剂的氧化酶催化效率有关键影响。在所研究的具有不同配位N数的Co-Nx(C)中，所构建的Co-N3(C)纳米酶表现出最高的催化效率。通过对其催化机制的深入研究，发现氧化酶类活性的结构依赖性是由于氧在Co-Nx活性位点上容易吸附和解离。
2、受益于明确的活性位点和明确的配位结构，开发的Co-Nx(C)纳米酶可以成功应用于各种比色分析。
转自：“科研一席话”微信公众号
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