导读
霍山石斛是一种重要的食用药用植物，可加厚肠胃，其活性成分多糖具有抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用。然而，霍山石斛多糖（DHP）的胃保护作用和潜在机制尚不清楚。本研究采用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导的人胃粘膜上皮细胞（GES-1）损伤模型，旨在结合多种方法研究DHP对MNNG诱导的GES-1 细胞损伤的保护作用及其潜在机制。DHP采用水提取和醇沉淀法提取，蛋白质采用Sevag法进行去除。我们使用扫描电子显微镜（SEM）观察形态学，并构建MNNG诱导的GES-1 细胞损伤模型；使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）研究实验细胞的细胞活力和增殖；使用荧光染料Hoechst 33342检测细胞核形态；使用Transwell室检测细胞划痕和迁移，免疫印迹检测实验细胞中凋亡蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3）的表达水平；采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）研究DHP的潜在作用机制。CCK-8试剂盒分析显示DHP增加了GES-1细胞的活力，并改善了MNNG对GES-1的损伤。此外，划痕试验和Transwell小室的结果表明，DHP改善了MNNG诱导的GES-1细胞的运动和迁移能力。同样，凋亡蛋白测定结果表明DHP对胃粘膜上皮细胞损伤具有保护作用。为了进一步研究DHP的潜在作用机制，我们使用UHPLC-HRMS分析了GES-1细胞、MNNG诱导损伤的GES-1和DHP+MMNG处理的细胞之间的代谢产物差异。结果表明，DHP上调1-甲基烟酰胺、法莫替丁、N4-醋磺胺甲恶唑、乙酰-L-肉碱、胆碱和神经酰胺(cer)（d18:1/19:0）代谢产物，并显著下调6-O-去甲基多奈哌齐、valet hamate、L-胱氨酸、propoxur和油酸。DHP可能通过烟酰胺和能量代谢相关途径保护胃粘膜细胞免受损伤。本研究可为进一步深入研究癌症、癌前病变和其他胃病的治疗提供有益的参考。
研究亮点：
1. 霍山石斛多糖(DHP)对MNNG诱导的GES-1 细胞损伤具有保护作用；
2. DHP上调1-甲基烟酰胺、法莫替丁、N4-醋磺胺甲恶唑、乙酰-L-肉碱、胆碱和cer（d18:1/19:0）代谢产物，并显著下调6-O-去甲基多奈哌齐、valet hamate、L-胱氨酸、propoxur和油酸；
3. DHP可能通过烟酰胺和能量代谢相关途径拮抗胃粘膜细胞损伤。
论文ID
原名：Mass spectrometry-based metabolomics reveal Dendrobium huoshanense polysaccharide effects and potential mechanism of N-methyl-N’- nitro-N-nitrosoguanidine -induced damage in GES-1 cells
译名：基于质谱的代谢组学研究揭示了霍山石斛多糖对胃粘膜上皮细胞损伤的作用及其潜在机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.03
通讯作者：彭代银
通讯作者单位：安徽中医药大学
实验设计
实验结果
1. DHP的理化性质
多糖是由多种单糖组成的聚合碳水化合物。为了更好地控制DHP的质量，我们对DHP的理化特性进行了表征。DHP的理化特性与文献报道的一致。DHP是一种乙酰化多糖，主要由葡萄糖和甘露糖组成（摩尔比 = 1: 2.41），具有α-和β-构型。其分子量为1.09 × 106Da。SEM分析显示DHP具有不规则形状和光滑表面（图1 C，D）。
图1 DHP的理化特性
（A）霍山石斛干燥茎，（B）DHP冻干粉，（C–D）DHP的SEM图像（C：100μm，D：1μm）。
2. DHP对MNNG诱导损伤的GES-1细胞活力的影响
为揭示DHP对MNNG诱导的GES-1 细胞损伤的影响，我们采用CCK-8法检测GES-1 细胞活力，使用CCK-8试剂盒测量用不同MNNG浓度（10–200μM）处理 24小时的GES-1细胞的生存能力。与对照组相比，MNNG以浓度依赖的方式降低了GES-1细胞的生存能力 。当MNNG浓度为40μM时，细胞增殖抑制作用达到正常细胞增殖水平的约60%，接近IC50值。因此，我们选择40μM MNNG处理24小时作为GES-1细胞损伤模型的最佳浓度（图2A）。
为排除DHP对GES-1 细胞的影响，本实验检测了不同浓度(μg/mL) DHP作用24 h后GES-1 细胞的活力。这些组中细胞在细胞活力方面没有显著变化（图2B）。这表明DHP没有细胞毒性。
为了评估DHP的胃保护作用，我们用不同浓度的DHP（400、800和1600μg/mL）预处理GSE-1细胞2小时，然后用MNNG（40μM）孵育24小时。1600μg/mL DHP下的细胞活力并不比800μg/mL或400μg/mL时的细胞活力好，这与单独暴露于40μM MNNG后的细胞活力有关（图2C），表明DHP具有胃保护作用，但细胞活力与剂量不成正比。
图2 MNNG和DHP对GES-1细胞活力的影响，以及DHP对MNNG诱导的GES-1细胞损伤的胃保护作用
（A） 用MNNG（10–200μM）处理GES-1细胞24小时。（B） 用DHP处理GES-1细胞24小时。（C） 用DHP预处理GES-1细胞2小时，然后用MNNG溶液（40μM）孵育24小时。与正常对照组相比，*p<0.05和**p<0.01。与MNNG组相比，#p<0.05和#p<0.01。
3. DHP对GES-1 细胞形态的影响
为了研究 MNNG和DHP处理的GES-1细胞的形态学，我们用荧光染料Hoechst 33342染色细胞核。图3 A显示，正常对照组细胞单层生长，排列有序，呈梭形形态(GES-1 细胞)。MNNG处理24 h后，我们观察到少量死亡的GES-1 细胞，细胞形态不规则，有触角（图3A），表明GES-1 细胞受损，低浓度的MNNG可高度致癌。从图中也可以明显看出，DHP对GES-1 细胞的损伤较小，且随着DHP浓度的增加，细胞数量逐渐增加。
图3 DHP对GES-1 细胞形态的影响
（A）倒置显微镜观察DHP处理对MNNG诱导的损伤细胞形态学的影响。（B）所有组均使用Hoechst 33342荧光显微镜染色进行观察。图中图例如下：对照组（GES-1 细胞）、模型组（40μM MNNG）、DHP L+MNNG（400μg/mL+40μM MNN）、DHP D+MNNG（800μg/mL+40μM MNNG）以及DHP H + MNNG (1600 μg/mL+40μM MNNG)。
此外，我们使用Hoechst 33342染色进行进一步验证，以证明DHP可以减轻对GES-1细胞的损伤 。从图中可以看出，对照组GES-1 细胞核形态规则，核膜完整，几乎没有蓝色荧光。而在模型组(40 μM MNNG)，细胞形态发生改变，呈核破裂变化，视野蓝光荧光强度极强。DHP处理干预后，这种情况明显改善。细胞的蓝色荧光强度随着DHP浓度的增加而逐渐降低（图3B），说明DHP对GES-1 细胞MNNG损伤的保护作用与减少凋亡有关。
4. DHP对细胞划伤及迁移的调节作用
如上所述，DHP已显示出改善MNNG诱导的GES-1 细胞损伤的外观和细胞活力。为了确定DHP和MNNG刺激对胃上皮细胞在水平运动和迁移能力方面的影响，在此，我们分别进行了细胞划痕实验和没有添加Matrigel的Transwell细胞迁移实验。划痕试验表明，与正常对照组相比，MNNG处理24小时的模型组划痕宽度显著缩小，细胞迁移能力更强（图4A，C）。此外，与MNNG处理后相比，DHP+MNNG组显著抑制细胞迁移，并且随着DHP浓度的增加，抑制能力逐渐增强（图4 C，D）。
图4 DHP和MNNG刺激对胃上皮细胞水平运动和迁移能力的影响
（A）在划痕实验期间用MNNG和DHP刺激GSE-1细胞不同的时间量（处理后0和24小时）。（B）在迁移实验期间，处理后24小时用MNNG和DHP刺激的GSE-1细胞。（C）划痕愈合率（%）。（D）划痕愈合的相对距离。（E）Transwell的迁移率（%）。与正常对照组相比，*p<0.05和**p<0.01。与MNNG组相比，#p<0.05和##p<0.01。
在未添加Matrigel的Transwell细胞迁移试验中，MNNG处理的GSE-1细胞与对照组相比仍具有显著的迁移能力。DHP预处理显著降低了MNNG诱导的这些细胞迁移的能力（图4 B，E）。
5. DHP在MNNG诱导的GES-1 细胞中调控凋亡相关蛋白的表达
先前的研究表明，胃粘膜上皮细胞凋亡是胃粘膜损伤发生的主要因素之一。为了确定MNNG诱导的GES-1细胞凋亡能否被DHP抑制，我们采用免疫印迹实验检测凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡促进蛋白Bax、Procaspase 3和裂解的caspase-3表达情况。40μM MNNG处理导致抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少，而促凋亡蛋白Bax显著增加，这与Bcl-2家族中两种众所周知的蛋白质线粒体稳态失衡密切相关（图5A，C，D）。与MNNG处理相比，DHP预处理改善了Bcl-2/Bax蛋白比率和caspase-3表达（图5 B，E）。
图5 DHP调节暴露于MNNG的GSE-1细胞中相关蛋白的表达
（A）WB检测40μm MNNG和400、800、1600μg/mL DHP暴露的GSE-1细胞内caspase-3、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax的表达。（B–E）caspase-3、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax表达的定量。与正常对照组相比，*p<0.05和**p<0.01。与MNNG组相比，#p<0.05和##p<0.01。
6. 多变量统计分析
为了进一步揭示DHP对于MNNG诱导GES-1细胞损伤的潜在保护机制，我们使用UHPLC-HRMS分析了GES-1细胞、MNNG诱导损伤的GES-1和DHP+MNNG处理的细胞之间的代谢产物差异。无监督PCA用于观察样品之间的总体分布和QC样品的聚集程度（图6 A，B）。PCA得分图显示NC、MNNG和DHP+MNNG组之间QC样本的良好聚集和样本的部分重叠，表明该方法具有极好的仪器稳定性和可行性。此外，为了更好地区分MNNG与NC组以及DHP+MNNG与MNNG组之间的差异，并提高模型的有效性和分析能力，我们通过监督OPLS-DA分析对这些进行了比较（图6C–F）。根据OPLS-DA评分图，MNNG与NC和DHP+MNNG与MNNG组在正离子/负离子模型中显著分离，证明两组之间的代谢产物存在差异。这说明MNNG和DHP可以改变细胞代谢。为防止OPLS-DA模型过拟合，我们采用200次response reciprocity检验方法对模型质量进行检验。R2Y（cum）表示模型在y轴方向上的累积解释率，Q2（cum）表示模型的累积预测能力。通常，当Q2的值大于0.5时，表明模型更稳定可靠。在本实验中，在正/负离子模式下，MNNG和NC组之间的R2Y和Q2结果为（1，0.516）（图6 E）和（1，0.956）（图6F）。在正/负离子模式下，DHP+MNNG和MNNG组之间的R2Y和Q2结果为（1，0.571）（图6 C）和（1，0.973）（图7 D）。200次response sequencing检验的结果清楚地表明，该模型在正/负离子模式下是可靠和准确的（图6G–J）。
表1 GES-1 细胞中潜在生物标志物的鉴定
图6 GES-1细胞代谢产物的多变量统计分析（PCA，OPLS-DA）
（A–B）正模式和负模式下的PCA得分。（C–D）OPLS-DA评分图分析比较了DHP+MNNG和MNNG组在正离子和负离子模式下的得分。（E–F）MNNG组和正常对照组在正离子和负离子模式下的OPLS-DA评分图。（G）通过正离子模式下的200次response reciprocity检验绘制DHP+MNNG和MNNG组的置换图。（H）通过正离子模式下的200次response reciprocity检验，MNNG和正常对照组的置换图。（I）通过负离子模式下的200次response reciprocity检验，绘制DHP+MNNG和MNNG组的置换图。（J）通过负离子模式下的200次response reciprocity检验，绘制MNNG和正常对照组的置换图。
表2 使用MetaboAnalyst 5.0在线对生物标志物进行通路分析
7. 潜在生物标志物的鉴定
OPLS-DA的多变量统计分析和单变量统计分析用于组间差异代谢物数据的分析。VIP > 1和t检验的p值<0.05用作OPLS-DA分析中挖掘生物显著差异代谢物的标准。我们确定并获得了11个潜在的生物标志物（表1）。与NC组相比，MNNG明显下调了1-甲基烟酰胺、法莫替丁、N4-醋磺胺甲恶唑、乙酰-L-肉碱、胆碱和cer（d18:1/19:0），并显著上调了6-O-去甲基多奈哌齐、valet hamate、L-胱氨酸、propoxur和油酸。然而，DHP预处理明显改变了代谢产物。
图7 使用在线MetaboAnalyst 5.0进行富集分析，分析与DHP保护作用相关的代谢途径
（A）代谢途径富集分析。（B）代谢途径拓扑分析。
8. 代谢通路分析
为了研究DHP保护细胞免受MNNG诱导的GSE-1细胞损伤的可能代谢途径，我们使用MetaboAnalyst 5.0的在线网页对11种生物标志物代谢途径进行了富集和拓扑分析。代谢物集富集概览图的纵坐标是代谢途径名称，横坐标是富集比率（途径中不同代谢物与总代谢物的比率）。结果表明，DHP对MNNG诱导的GSE-1损伤的保护作用与八种代谢途径有关，包括磷脂酰乙醇胺生物合成、磷脂酰胆碱生物合成和极长链脂肪酸的β氧化的富集率（图7A）。
网络拓扑分析图中的每个圆圈代表一个代谢途径，圆圈大小和颜色的变化代表代谢途径影响的程度。结果表明，DHP对MNNG诱导的GES-1细胞损伤具有保护作用与烟酸和烟酰胺代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；不饱和脂肪酸的生物合成；甘油磷脂代谢；以及其他等有关（表2，图7B）。
讨论
GC是近年来发病率和死亡率较高的疾病。从慢性浅表性胃炎到慢性萎缩性胃炎、肠化生、异型增生、早期癌症和晚期癌症是一个多步骤的过程。然而，由于早期癌症症状不明显，治疗预后差，病因复杂，往往难以发现和治疗。因此，逆转胃癌前病变是预防和治疗癌症的关键。中国在预防胃癌前病变方面具有中医方法的优势。目前，中医药在治疗胃癌前病变方面取得了非凡的成就，引起了国内外学者的关注。
霍山石斛是一种药食同源物，是安徽省的一种正宗药材。此外，它还优于其他石斛属植物。霍山石斛最早记载于《神农本草经》，这是世界上最早的草药古籍，被列为具有养胃功效的上等草药。霍山石斛的主要成分多糖与其药理活性密切相关。因此，多糖含量不应低于17.0%，这是《中国药典》（第20版）中判断霍山石斛质量的主要标准之一。许多研究表明，霍山石斛具有有效的抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用。
我们的研究中观察到DHP由葡萄糖和甘露糖组成（摩尔比为1:2.41）。这与其他文献报道中的多糖相对不同。作为一种精制的多糖，它尚未被进一步纯化和分离，因此其化学结构需要深入研究。本研究旨在阐明DHP对MNNG诱导的人胃上皮细胞损伤的保护作用及其潜在的作用机制。本研究证明DHP可改变MNNG诱导GSE-1细胞损伤的模型，以及癌症细胞的特征、细胞形态和细胞运动。DHP对GES-1 细胞有保护作用。MNNG (40 μM)能显著抑制GES细胞的增殖，这与文献报道一致。DHP预处理可以防止这种抑制。GES-1与40μM MNNG孵育显著改变了细胞运动性和增加了细胞流动性，而MNNG的作用可以通过DHP预处理来逆转。这些结果表明，DHP可以逆转胃上皮细胞的凋亡，目的是保护胃上皮细胞免受MNNG引起的损伤。
胃粘膜上皮细胞凋亡是胃粘膜损伤发生发展的主要因素之一。在先前的研究中，Bax和caspase 3促进细胞凋亡，而Bcl-2抑制细胞凋亡，Bcl-2与Bax的比率是细胞凋亡的关键决定因素。当发生凋亡时，Caspase-3和Bax的表达增加，而Bcl-2的表达减少。在我们的研究中，DHP预处理显著提高了Bcl-2的表达，降低了Bax和caspase 3的表达，提高了Bcl-2/Bax的比值，表明DHP抑制细胞凋亡，从而减少胃粘膜损伤。
为了进一步研究DHP对MNNG诱导的胃粘膜损伤的机制，UHPLC-HRMS用于分析GES-1 细胞组与MNNG（40 μM MNNG诱导的GES-1细胞）组，以及MNNG组与DHP + MNNG组之间的代谢产物差异。我们得出的结论是，DHP增加了1-甲基烟酰胺、法莫替丁、N4-醋磺胺甲恶唑、乙酰-L-卡尼汀、胆碱和cer（d18:1/19:0）的水平，并降低了6-O-去甲基多奈哌齐、valet hamate、L-胱氨酸、propoxur和油酸的水平，这保护了胃粘膜上皮细胞。1-甲基烟酰胺已成为一种抗血栓和抗炎剂。神经酰胺（cer）是一种由脂肪酸和鞘氨醇组成的生物活性物质。它在神经系统的鞘脂代谢中充当第二信使分子。PSAP也被认为是GC研究中潜在的预后生物标志物，能促进肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡。6-O-去甲基多奈哌齐是多奈哌齐尔的主要活性代谢产物，可诱导胃肠粘膜损伤。值得注意的是，这些代谢产物的变化与炎症反应和胃粘膜损伤有关。
KEGG表明DHP对MNNG诱导的GES-1 细胞损伤的保护作用与烟酸盐和烟酰胺代谢有关。众所周知，MNNG会导致DNA损伤，从而导致慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃异型增生和癌症。在我们的研究中，MNNG组中1-甲基烟酰胺的表达降低，说明GES-1 细胞中烟酸盐和烟酰胺代谢明显受到干扰。1-甲基烟酰胺是烟酰胺代谢产物。然而，烟酰胺是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体之一，参与能量代谢、细胞免疫和DNA损伤识别和修复。NAD+可通过激活SIRT1抑制NF-кB信号通路中炎症因子的释放，从而达到抗炎作用。此外，烟酰胺通过改善胃粘膜出血、降低胃微血管通透性和减少炎症反应来保护胃粘膜。实验结果证实DHP可以通过调节烟酸和烟酰胺的代谢途径和能量代谢来保护胃粘膜损伤并促进胃粘膜修复，这与先前的研究结果一致。
结论
总之，DHP是一种无毒的大分子物质，具有多种生物活性。本研究的结果表明，DHP可为霍山石斛治疗慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、GC和其他疾病的临床研究提供物质基础。然而，这项研究有一些局限性。本研究中的剂量依赖性无统计学意义。此外，这需要在动物模型中进一步验证，以探索DHP的胃粘膜保护机制。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123002106?via%3Dihub
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