随着我国人口老龄化的快速发展以及人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病的患病率持续增长。《中国2型糖尿病防治指南 (2020年版)》中显示，我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%，糖尿病知晓率（36.5%）、治疗率（32.2%）和控制率（49.2%）虽然有所改善，但仍处于低水平[1]。糖尿病并发抑郁症发病隐匿，临床不易诊断，但却严重干扰患者的治疗依从性，影响治疗效果。研究表明，糖尿病全身性代谢紊乱可损伤中枢神经元的功能并造成细胞凋亡或死亡，进而引发抑郁情绪、认知功能减退等行为障碍[2]。最新的研究发现，高糖还会引起海马齿状回区神经干细胞的神经发生功能异常，即神经干细胞向新生神经元的分化、迁移和成熟减少[3]。而促进海马神经干细胞的增殖与分化已成为抗抑郁研究的新方向[4]。
左归降糖解郁方是课题组依据糖尿病并发抑郁症滋阴益气、化瘀解郁治法，对左归丸进行加减而得，专利号为ZL.201910073295.8。前期动物实验发现，左归降糖解郁方对海马无翅基因3a（recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a）的表达具有较好的调节作用[5]。其中，β-连环蛋白（β-catenin）是Wnt3a信号中的核心蛋白。当Wnt3a信号被激活时，β-catenin降解减少而蓄积增加，大量β-catenin进入细胞核并与T细胞因子/淋巴增强因子家族（T-cell factor/ lymphoid enhancing factor，TCF/LEF）结合，激活下游靶基因的转录，从而发挥调节神经干细胞增殖与分化的功能[6]。故本研究拟通过体外细胞实验，以β-catenin为研究重点，进一步明确左归降糖解郁方调控Wnt3a/β-catenin信号改善神经干细胞增殖与分化的机制与靶点。
1 材料
1.1 动物
体外培养的海马神经干细胞来源于SPF级SD新生鼠（新生24 h内），制备含药血清的动物来源于SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，以上动物均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号为SCXK（湘）2019-0004。动物实验通过湖南中医药大学第一附属医院动物实验伦理审查（批准号ZYFY20221111-55）。
1.2 药物
左归降糖解郁方由熟地黄15 g、山茱萸12 g、枸杞12 g、菟丝子9 g、贯叶金丝桃3 g、丹参12 g、牡丹皮6 g、姜黄9 g、牛膝9 g、杜仲9 g、黄芪18 g组成，熟地黄购自扬子江药业集团江苏龙凤堂中药有限公司，姜黄购自湖南仁上正元中药饮片有限公司，杜仲购自安徽普仁中药饮片有限公司，其余药材均购自湖南中医药大学第一附属医院。所有药材均由湖南中医药大学第一附属医院中药房张志国教授鉴定，熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的块根经加工蒸晒而成，山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，枸杞为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，菟丝子为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子，贯叶金丝桃为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，姜黄为姜科植物姜黄Curcuma Longa L.的干燥根茎，牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根。课题组采用LC-MS/MS法对左归降糖解郁方的成分进行了定性定量分析，共鉴定出30种化合物，并对5种主要成分进行了定量分析，含马钱苷3.48 mg/g、芍药苷2.05 mg/g、丹酚酸B 1.08 mg/g、毛蕊异黄酮苷1.66 mg/g和梓醇2.46 mg/g。
1.3 药品与试剂
DMEM/F12培养基（批号AF29584968）购自美国Hyclone公司；B27（2185851）购自美国Gibco公司；大鼠表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF，批号1009390F0619）、大鼠碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF，批号1210432-1C2819）购自Peprotech公司；皮质酮（批号SLBJ5337V）购自美国Sigma公司；Brdu（批号16L08A00）购自博士德生物公司；Wnt3a信号抑制剂XVA-939（批号HY-15147）购自MedChemExpress公司；巢蛋白（Nestin）抗体（批号19483-1-AP）、β-catenin抗体（批号51067-2-AP）、CoraLite594标记的山羊抗小鼠IgG抗体（批号SA00013-3）购自Proteintech公司；神经元核抗原（neuron specific nuclear protein，NeuN）抗体（批号AF300513）购自艾方生物科技有限公司；双皮质素（doublecortin，DCX）抗体（批号4604）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）抗体（批号5731S）、LRP6抗体（批号2560S）、Wnt3a抗体（批号2721）、核纤层蛋白B1（Lamin B1）抗体（批号13435）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（批号80788S）购自美国CST公司；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号BM0627）、FITC标记的山羊抗小兔IgG抗体（批号BA1105）购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.4 仪器
OPER-ETTA型高内涵细胞成像分析系统（美国PerkinElmer公司）；TD25-WS型低速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；S8PAO型体视显微镜（德国Leica公司）；Mini Trans-Blot蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司）；FluorChem R超灵敏多色荧光成像分析系统（美国ProteinSimple公司）。
2 方法
2.1 海马神经干细胞的分离、培养与鉴定
取24 h的新生SD大鼠，将全身用75%酒精擦拭消毒后，于体视显微镜下取全脑，置于D-Hanks溶液中漂洗干净；随后剥离外层血管膜，取双侧海马，摘除海马中的出血点及血管膜后，移至干细胞条件培养基中（100 mL条件培养基的配比为95.6 mL DMEM/F12、2 mL B27、0.2 mL EGF、0.2 mL bFGF、1 mL非必需氨基酸和1 mL双抗）。上述全过程均需要在冰盒上完成以保证细胞活力。接着采用1 mL移液枪反复吹打直至海马组织成为混悬液，吹打动作需轻柔以免损伤细胞，细胞过筛滤去黏膜，800 r/min离心5 min，弃去上清液并将沉淀细胞进行重悬，按照2×105个/mL的密度，将上述单细胞悬液培养于6孔板中且隔天换液。细胞培养至第3天开始成球并不断增殖，到第8天神经干细胞球的大小平均约为150 μm，需进行传代，传代方法同上，传代后杂细胞少见，干细胞的增殖能力较好；本实验采用第3代神经干细胞进行实验。
2.2 含药血清的制备
按照课题组方法[7]制备左归降糖解郁方含药血清，步骤如下：雄性SD大鼠ig左归降糖解郁方（32.82 g/kg，相当于3倍临床等效剂量），空白血清组ig等体积蒸馏水，每日2次，连续给药3 d。末次给药1 h后，腹主动脉取血，4500 r/min离心15 min，收集血清后于56 ℃金属浴锅灭活30 min，−80 ℃超低温冰箱冷藏保存，以备后续实验使用。通过UPLC-ESI-Q/TOF对左归降糖解郁方含药血清中的物质基础进行分析，共鉴定出32个入血成分，并明确了包括马钱苷酸、金丝桃苷、马钱苷、芍药苷、莫诺苷等在内的活性成分群。
2.3 体外细胞造模及药物干预
将体外培养的第3代神经干细胞分为正常组、模型组、空白血清组、左归降糖解郁方含药血清组和XAV-939组。采用课题组已有建模条件高糖（150 mmol/L）和皮质酮（200 μmol/L）干预细胞[8-10]，建立模拟糖尿病并发抑郁症脑环境下的海马神经干细胞体外模型，正常组给予等体积的PBS，干预时间为24 h。同时，左归降糖解郁方含药血清组加入10%左归降糖解郁方含药血清，XAV-939组加入10%左归降糖解郁方含药血清和XAV-939（5 μmol/L），空白血清组加入10%空白血清，正常组和模型组分别加入培养液。
2.4 检测指标
2.4.1 干细胞活力检测 将体外培养的第3代神经干细胞制成细胞悬液并接种于96孔板中，细胞密度为1×105个/孔，每孔100 μL，实验孔四周用无菌PBS进行填充。将各组进行相应干预及处理后，每孔加10 μL WST-1溶液，继续培养4 h，在450 nm处测定每孔的吸光度（A）值。
2.4.2 干细胞增殖功能检测 在体外培养的第3代神经干细胞条件培养基中加入Brdu，终浓度为10 μmol/L，并于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养72 h。随后，将干细胞球转移至新的6孔板中（板底铺经多聚赖氨酸包被过的细胞爬片），在培养基中添加10%胎牛血清以促进神经球贴壁。各组细胞建模及药物干预，24 h后取出细胞爬片。采用免疫荧光方法对神经干细胞中的Brdu进行显色，吸去培养基，用PBS漂洗细胞3次，每次5 min，所有加液及吸液均应轻柔缓慢进行以减少细胞脱片。每张爬片上依次加入足量4%多聚甲醛室温避光固定30 min后吸去，PBS洗涤；加入足量0.3% Triton-100室温避光孵育15 min后吸去，PBS洗涤；加入足量BSA室温避光孵育60 min后吸去，PBS洗涤；加入Brdu抗体（1∶200），150 μL/片。将爬片放入湿盒中，于4 ℃过夜。次日，吸去一抗，PBS洗涤；加入相应二抗（1∶200），150 μL/片，室温避光孵育60 min，PBS洗涤；加入DAPI染液，150 μL/片，避光10 min后吸去，PBS洗涤，滴加抗荧光猝灭剂，于激光共聚焦显微镜下观察、拍摄及分析。
2.4.3 干细胞分化功能检测 收集第3代神经干细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃去上清，加入含有10%胎牛血清的条件培养基，反复吹打后接种于铺有细胞爬片（预包被）的6孔板中，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h，随后进行建模及药物干预，24 h后取出细胞爬片，采用免疫荧光方法检测细胞中DCX、GFAP、NeuN的表达，细胞按照“2.4.2”项下方法处理后，分别加入一抗DCX（1∶100）、GFAP（1∶100）、NeuN（1∶100），150 μL/片，4 ℃孵育过夜。次日，吸去一抗，PBS洗涤；加入相应二抗（1∶200），150 μL/片，室温避光孵育60 min，PBS洗涤；加入DAPI染液，150 μL/片，避光孵育10 min后吸去，PBS洗涤，滴加抗荧光猝灭剂，于激光共聚焦显微镜下观察、拍摄及分析。
2.4.4 Western blotting检测 各组细胞造模及药物干预24 h后，收集细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃去上清，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，提取蛋白并定量，加入上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入一抗低温孵育过夜。次日，将膜放置于室温下平衡30 min，弃去一抗并用TBST漂洗5次，然后加入相应的二抗，于摇床中孵育1 h，弃去二抗并用TBST漂洗5次，最后进行ECL显色，采用超灵敏多色荧光成像分析系统进行曝光及灰度值计算。
2.4.5 qRT-PCR检测 采用Trizol提取各组大鼠海马齿状回的总RNA，随后反转录得cDNA。采用qRT-PCR法扩增细胞周期蛋白D1（cyclinD1）和神经元素2（neurogenin 2，Ngn2），引物序列：cyclinD1上游引物5’-GAGACCACAGCCCTCCCCAGA- CGG-3’，下游引物5’-AAGCGGTCCAGGTAGTTC- ATGG-3’；Ngn2上游引物5’-TCGTCAAATCTGA- GACTCTGGAG-3’，下游引物5’-CGGCGCAGC- TCCTCGTCCT-3’；β-actin上游引物5’-CCGAG- CGTGGCTACAGCTTC-3’，下游引物5’-ACCTG- GCCGTCAGGCAGCTC-3’。反应体系为20 μL，包含SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。反应程序为95 ℃、3 min，95 ℃、8 s，60 ℃、30 s，72 ℃、25 s，40个循环。
2.5 统计分析
所有数据以表示，并采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）。
3 结果
3.1 海马神经干细胞的形态学及标记物鉴定结果
如图1所示，海马中分离培养的原代神经干细胞均为单细胞且悬浮于培养基中，随着培养时间的延长，干细胞不断增殖形成悬浮细胞球。显微镜下可见细胞球饱满，立体感较强，透光性良好。对不同培养阶段的悬浮神经干细胞球进行Nestin免疫荧光标记（图2），其中Nestin为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光，神经干细胞在培养第3天，可形成直径约50 μm的神经球，在培养第6天，直径可达100 μm。
3.2海马神经干细胞的活力检测结果
如图3所示，与正常组比较，模型组、空白血清组、XAV-939组神经干细胞A值明显降低（P＜0.05、0.01）。与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组神经干细胞的A值均明显升高（P＜0.01），提示左归降糖解郁方可显著提升受损神经干细胞的活力。与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV-939组神经干细胞的A值明显降低（P＜0.05），提示XAV-939显著抑制了左归降糖解郁方对神经干细胞活力的增强作用。
3.3 海马神经干细胞的增殖检测结果
如图4所示，与正常组比较，其余各组Brdu的A值显著减少（P＜0.01）；与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组神经干细胞Brdu的A值均显著增加（P＜0.01），提示左归降糖解郁方可增加干细胞的增殖能力。与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV-939组神经干细胞Brdu的A值显著降低（P＜0.01），提示XAV-939抑制了左归降糖解郁方对神经干细胞增殖的促进作用。
3.4 海马神经干细胞的分化功能检测结果
通过标记DCX、GFAP、NeuN评估神经干细胞的分化功能，如图5所示，DCX标记的是新生神经元，与正常组比较，其余各组神经干细胞中DCX表达均显著降低（P＜0.01）；与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方可显著升高DCX表达（P＜0.01），提示左归降糖解郁方可显著增强神经干细胞向新生神经元的分化；与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV-939组DCX表达显著减少（P＜0.01），提示XAV-939可抑制左归降糖解郁方的上述促分化作用。
GFAP用以标记星形胶质细胞，与正常组比较，其余各组神经干细胞中GFAP表达均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，空白血清组、左归降糖解郁方含药血清组、XAV-939组的GFAP表达均明显增加（P＜0.05、0.01）；与空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组GFAP表达显著增加（P＜0.01），提示虽然空白血清对神经干细胞向星形胶质细胞分化具有一定的促进作用，但左归降糖解郁方对于该分化方向的促进作用更强；与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV-939组GFAP表达显著减少（P＜0.01），提示XAV-939可抑制左归降糖解郁方对神经干细胞向星形胶质细胞分化的作用。
NeuN标记成熟神经元，与正常组比较，其余各组神经干细胞中NeuN表达均显著降低（P＜0.01）；与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组NeuN表达均显著升高（P＜0.01），提示左归降糖解郁方可显著促进新生神经元的成熟；与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV-939组NeuN表达显著减少（P＜0.01），提示XAV-939可抑制左归降糖解郁方对新生神经元成熟的促进作用。
3.5 海马神经干细胞中Wnt3a信号通路蛋白检测
分别对Wnt3a信号的上游分子Wnt3a、LRP5、LRP6以及其下游β-catenin进行检测，结果见图6。Wnt3a信号上游蛋白结果显示，与正常组比较，模型组和空白血清组Wnt3a、LRP5、LRP6蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，空白血清组、左归降糖解郁方含药血清组和XAV939组Wnt3a表达显著升高（P＜0.05、0.01）；左归降糖解郁方含药血清组和XAV939组LRP5、LRP6表达均显著升高（P＜0.01）。与空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组和XAV939组Wnt3a、LRP5、LRP6蛋白表达显著升高（P＜0.01）。左归降糖解郁方含药血清组与XAV939组之间上述3个蛋白表达没有显著性差异。提示左归降糖解郁方能够显著升高海马神经干细胞中Wnt3a、LRP5、LRP6 3个蛋白的表达，即对Wnt3a信号具有较好的促进作用，而XAV939则对以上蛋白无明显抑制效果。
Wnt3a信号下游蛋白结果显示，与正常组比较，模型组、空白血清组和XAV939组细胞中总β-catenin和核β-catenin的表达均显著降低（P＜0.01）。与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组总β-catenin和核β-catenin的表达均显著升高（P＜0.01），提示左归降糖解郁方能够显著增加β-catenin的表达及入核。与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV939组细胞中总β-catenin和核β-catenin的表达显著降低（P＜0.01），提示XAV939可通过降解β-catenin并减少其入核，从而阻断Wnt3a信号下游的信号传导。
3.6 海马神经干细胞中Wnt3a信号调控因子的表达
如图7所示，与正常组比较，模型组、空白血清组、XAV939组cyclinD1和Ngn2的mRNA表达显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组和空白血清组比较，左归降糖解郁方含药血清组cyclinD1和Ngn2的mRNA表达均显著升高（P＜0.05、0.01），XAV939组Ngn2的mRNA表达显著升高（P＜0.05），提示左归降糖解郁方能显著增加神经干细胞中cyclinD1和Ngn2的转录；与左归降糖解郁方含药血清组比较，XAV939组cyclinD1和Ngn2的mRNA表达显著降低（P＜0.05、0.01），提示XAV939抑制了上述因子的转录表达。
4 讨论
海马神经干细胞具有增殖和分化等功能，可通过不断产生新的神经细胞，参与神经网络的整合和功能发挥，在海马依赖的情绪和认知调节中展现出越来越重要的作用。目前，海马神经干细胞功能减退已成为糖尿病脑病以及抑郁症发生机制的研究热点，以神经干细胞为靶细胞的降糖及抗抑郁药研究逐渐增多[11-12]。然而，上述研究大多以动物实验为主，细胞实验较为少见，故建立贴合在体表现的体外细胞模型将有助于深入开展对糖尿病并发抑郁症海马神经干细胞的研究。课题组前期采用葡萄糖（150 mmol/L）和皮质酮（200 μmol/L）联用的方式，模拟糖尿病并发抑郁症脑环境，对体外神经元、小胶质细胞、神经血管单元等多种神经细胞/细胞系进行刺激干预，体外细胞功能与形态的病理表现与在体相似，为糖尿病并发抑郁症的在体研究提供了有力佐证[7-10]。本研究采用上述建模条件，对体外培养的神经干细胞进行干预，结果发现，葡萄糖和皮质酮干预体外神经干细胞后，干细胞活力减弱且增殖能力下降，其向神经元和星形胶质细胞分化的程度明显降低，该结果与糖尿病并发抑郁症大鼠海马齿状回神经干细胞的增殖与分化功能下降保持一致，可作为细胞模型用于后续研究。
左归降糖解郁方是课题组根据糖尿病并发抑郁症“虚、瘀、郁”病机，在经典名方左归丸的基础上加减而得，能够有效降低糖尿病并发抑郁症大鼠外周高血糖和高血脂，改善动物的抑郁样行为[13-15]。已有研究表明，该方中的部分药味对海马神经干细胞功能具有较好的调节作用。如山茱萸能够显著增加正常大鼠海马齿状回Brdu和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2）的阳性细胞数，促进内源性神经干细胞的增殖与分化[16]。姜黄可通过调控海马脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）信号通路促进糖尿病脑病大鼠海马区神经发生，从而改善动物的空间记忆障碍[17]。杜仲可通过影响小鼠的肠道菌群促进海马成体神经干细胞的增殖，以及新生神经元细胞的分化和存活，进而提高动物的学习记忆能力[18]。本研究发现，左归降糖解郁方能够明显提高葡萄糖和皮质酮对体外海马神经干细胞活性的抑制作用，增强干细胞增殖能力，改善细胞分化功能。首先，WST-1作为MTT的升级替代产品，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，其还原后的产物具有水溶性，更适合悬浮细胞的活力检测，且WST-1稳定型更好、灵敏度更高。实验发现，左归降糖解郁方干预后的干细胞A值明显增加，即对干细胞活力的增强作用较为明显。其次，实验采用经典的Brdu对干细胞内新合成的DNA进行标记，用以评价细胞的增殖情况。结果发现，左归降糖解郁方能显著增加干细胞球中Brdu的荧光强度，促进干细胞的增殖。最后，采用DCX、NeuN、GFAP对神经干细胞的分化功能进行评估，其中，DCX、NeuN用于评价其分化成神经元的能力，GFAP为其分化成星形胶质细胞的能力。结果发现，左归降糖解郁方能够显著增加神经干细胞分化过程中DCX、NeuN、GFAP的表达，即增强干细胞向神经元和星形胶质细胞的分化能力。
Wnt家族可通过经典与非经典信号通路参与调节体内多种细胞的增殖、分化、迁移和极化等过程，且以经典Wnt信号的研究最为广泛和深入。Wnt家族中的Wnt3a成员所介导的Wnt3a/β-catenin经典信号在调节海马齿状回神经发生中发挥了重要作用，并可通过调节神经干细胞的命运走向而影响动物行为[19]。慢病毒介导的Wnt3a过表达不仅可诱导成年大鼠齿状回的神经发生，也可增加体外神经祖细胞的增殖[20]。本研究结果表明，左归降糖解郁方可显著提高体外培养的海马神经干细胞中Wnt3a的表达，该结果与之前动物实验的结果保持一致[5]。此外，实验发现，左归降糖解郁方可增加神经干细胞中LRP5/6的表达水平。LRP5和LRP6是Wnt3a信号激活的重要受体，其通过与Wnt3a、FZD形成三元复合物，实现对蓬乱蛋白同源物（dishevelled，Dvl）、Axis抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）和糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的募集。此时，由Dvl、Axin、CK1和GSK-3β形成的降解复合体无法发挥对β-catenin的磷酸化作用，使得β-catenin的泛素化被抑制而减少降解。β-catenin在胞质中不断蓄积，最终进入细胞核启动下游基因表达[21]。由此可见，左归降糖解郁方可通过增加Wnt3a与LRP5/6的表达，促进降解复合体的募集，从而减少β-catenin的降解，增加其入核。
β-catenin进入细胞核并启动下游靶基因转录的过程是Wnt3a/β-catenin信号调控干细胞增殖和分化作用的关键。细胞质中游离的β-catenin进入到细胞核，与TCF/LEF相结合形成转录复合体，激活下游Ngn2、cyclinD1等基因转录，cyclinD1主要刺激神经干细胞增殖而Ngn2主要促进干细胞的分化和神经元的成熟[22]。故对神经干细胞核中β-catenin的蛋白及下游靶基因的表达进行了检测。结果发现，左归降糖解郁方能显著增加神经干细胞核中的β-catenin蛋白表达以及Ngn2和cyclinD1的mRNA表达。此外，选择化学抑制剂XAV-939进行验证。XAV939是一种细胞可穿透性的Wnt3a/β-catenin信号转导抑制剂，可通过抑制多聚ADP-核糖基化酶Tankyrase1和Tankyrase2，稳定降解复合体成分Axin，从而刺激β-catenin降解，减少其进入细胞核的量。结果发现，给予XAV939后，左归降糖解郁方对神经干细胞增殖、分化的改善作用被抑制，细胞核中β-catenin蛋白和Ngn2、cyclinD1的mRNA表达均显著减少，但Wnt3a、LRP5和LRP6的表达没有明显改变。该结果提示，在增加神经干细胞中β-catenin的降解后，左归降糖解郁方虽仍可增强Wnt3a的表达，但无法通过促进β-catenin的入核而增加神经发生相关因子的转录，继而失去对神经干细胞功能的调节作用，推测β-catenin可能是左归降糖解郁方的关键作用靶点。
综上所述，左归降糖解郁方可明显改善模拟糖尿病并发抑郁症脑环境下海马神经干细胞的增殖与分化功能，上述作用与其调控Wnt3a/β-catenin信号，增加β-catenin入核，促进神经干细胞功能相关基因转录有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：杨 蕙，雷诗卉，李 薇，孟 盼，王瑾茜，刘 检，王宇红．左归降糖解郁方调控经典Wnt信号改善糖尿病并发抑郁症海马神经干细胞增殖与分化研究 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2163-2171.
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