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题目：Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations
期刊：Nature
IF：69.504
发表时间：2023年3月15日
通讯作者单位：霍华德·休斯医学研究所
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05828-9
主要内容：
基因编码钙指示剂（GECI）是对细胞内钙离子（Ca）作出反应的设计蛋白2+）通过发光的神经元激活过程中发生的流入。GECIs使研究人员能够深入了解大脑的运作，但到目前为止，这些蛋白质还缺乏在单个神经元中记录基本活动单位（称为动作电位）的精度。作者的研究标志着朝着解决此问题迈出的一步的GECI。
照亮大脑的灯
想象一下，在夏夜划过寂静黑暗的水域，当水突然被无数水母的灿烂光芒所改变时，照亮了一个隐藏的活动世界。在1960年代，华盛顿星期五港实验室的科学家手工收集了近10，000个水母标本，目的是分离出负责这种自然生物发光的有机成分。科学家们提取并纯化了一种钙敏感蛋白，他们将其命名为aequorin，以及相关的绿色荧光蛋白（GFP）。不久之后，研究人员将纯化的水母蛋白加载到活细胞中以跟踪钙的变化。一种对神经元活动至关重要的离子。这种通过代理测量神经元活动的能力 - 通过闪光 - 彻底改变了神经科学领域，并导致识别大脑中以前未知的动力学。
通过将水母蛋白注射到神经元中，科学家们发现了细胞内钙水平的变化由神经元激活产生，有助于这些细胞释放神经递质以相互交流的过程。在水母蛋白首次被分离出几十年后，另一个突破以GECIs的形式出现。虽然水母蛋白和其他钙敏感染料需要手动加载到细胞中，但GECI被设计成生物体DNA的一部分。使用最广泛的GECI，称为GCaMP家族，由一种称为钙调蛋白的钙结合蛋白和结合肽（一小串氨基酸）组成，融合到修饰形式的 GFP 上。当与钙调蛋白结合，这会触发融合蛋白的构象变化，从而导致GFP发光（图1a）。
尽管这些钙传感器具有潜力，但GCaMP的早期版本受到诸如响应动力学差，钙敏感性低以及与神经元电活动相关性有限的等问题的阻碍。传感器的初始版本只能检测到Ca的较大变化。由数十个动作电位带来，响应动力学约为数百毫秒。
此后，作者一直致力于通过结构引导设计来提高GCaMP传感器的性能。更高版本的GCaMP甚至针对灵敏度或速度进行了优化，“慢速”变体可最大化信号强度，“快速”变体可最大化响应动力学。GCaMP的快速变体现在可以在数十毫秒的时间范围内检测钙的变化。还开发了其他GECI，它们响应Ca发出不同波长的光。使多个神经元群能够同时成像。
这些进步使科学家能够利用GECI的多功能性，特异性和持久性。它们被基因编码的事实允许它们同时在许多细胞中连续表达。这有助于对苍蝇、啮齿动物和灵长类动物的大量细胞进行体内测量。GECIs表达的细胞类型也可以通过遗传控制，这有助于研究人员了解神经回路的变异性。例如，GECI已被用于描绘大脑皮层中神经元的亚群，这些亚群具有不同的钙动力学和在决策中的作用。它们也被用来测量钙在大脑中的非神经元细胞中。例如，星形胶质细胞（大脑中最丰富的非神经元细胞类型）的钙成像揭示了多巴胺等神经递质如何塑造星形胶质细胞对神经活动的反应。
尽管如此，最新的GCaMP迭代未能可靠地识别活体大脑“嘈杂”条件下的个体动作电位。几个研究小组一直在竞相确定GCaMP变体，这些变体可以在不牺牲亮度的情况下检测这些变化 - 这些变化发生在几毫秒内。作者的工作为这场比赛介绍了竞争对手，并指出了钙成像的光明未来。
单动作电位是神经交流的基本单位。因此，作者的发展是一个重大的进步。作者的GCaMP8传感器的动力学速度明显快于现有的最先进的GECI（图1b），例如GCaMP7和XCaMP系列。GCaMP8传感器还避免了灵敏度和速度之间的典型权衡，即较慢的传感器动力学会产生更大的光学响应。
作者的传感器基于GCaMP6。作者通过设计其几个模块的不同版本来优化这种蛋白质，包括将GFP连接到结合肽和钙调蛋白结构域的两个接头，当钙时捕获肽。绑定。他们特别注意结合肽（GCaMP8中是内皮一氧化氮合酶的片段）与钙调蛋白结构域之间的界面，因为传感器的该区域在其响应和动力学中起着至关重要的作用。然后，该团队使用了一个优化过程，包括替换许多氨基酸并进行几轮测试，以确定性能最佳的传感器。他们验证了这些指标在苍蝇和小鼠中的性能。GCaMP8传感器的强劲性能表明，钙该系列中的诱导荧光与其他GCaMP中的荧光不同。
GCaMP8传感器的快速动力学和高精度将使研究人员能够分析活体动物的现象，这些现象以前只能通过使用电测量或基因编码电压指示器（GEVI）进行研究，这些现象通过荧光响应电压变化（很像GECI对钙的反应）。到目前为止，人们一直假设GECI和GEVI报告不同类型的神经活动 - GEVI确定动作电位的时间，GECI揭示神经元区室中的关键活动（例如，通过测量Ca2+称为树突的过程中的动力学，从其他神经元接收信号）。
然而，随着GCaMP8的发展，可以从这些工具中获得的信息已经融合。作者通过对GCaMP8释放的光脉冲的计算分析表明，他们的传感器可以像电压成像一样准确地检测动作电位。同样，GCaMP8可以可靠地检测通常经常放电的苍蝇神经元何时变得短暂不活跃，提供与基于GEVI的测量相似的结果。
当电压和钙成像可用于同时记录许多神经元时，实际的实验考虑可能会说服未来的研究人员选择钙成像而不是电压成像。GCaMP8与现有的显微镜配置和制备方法兼容。该系列可用于检查广泛神经元网络的活动，其规模比使用电压成像更大。人们可能会想象，GCaMP8系列将很快用于解释详细的，毫秒一毫秒的活动序列，这些活动序列流经大脑特定区域中的许多神经元。
与这一代GCaMP相关的快速动力学以及现有的GEVI将推动快速光学显微镜和成像技术的发展。这种显微镜将能够同时检测从许多神经元发出的瞬态光。但就目前而言，钙传感器动力学不再是解释快速神经活动的瓶颈这一事实将受到许多神经科学家的欢迎。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05828-9
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