ChIP-seq、CUT & Tag 等都是常见的研究体内蛋白质与 DNA 相互作用的有力工具，但这些传统方法无法获得每一个大片段 DNA 分子上蛋白结合的真实状态，无法进行 DNA 复杂结构域蛋白-DNA 交互作用的分析，使得蛋白-DNA 交互作用在单分子水平上的研究受到限制。
2023 年 3 月 29 日，华大基因唐冲博士团队于基因组学顶级期刊 Genome Biology 发表重要科学论文「BIND & MODIFY: a long-range method for single-molecule mapping of chromatin modifications in eukaryotes」（点击文末「阅读原文」查看文献）。
文章发表于 Genome Biology
该文章介绍了一种基于构建葡萄球菌蛋白 A-甲基转移酶融合重组蛋白，对抗体结合的组蛋白修饰、DNA 结合蛋白附近的 DNA 进行特异性定点甲基化修饰，并通过长读长测序获得高精度的、DNA 单分子水平上的组蛋白修饰及 DNA 结合蛋白序列信息。
传统的基于 ChIP-seq 的蛋白-DNA 互作研究方法，利用抗体免疫沉淀后富集的打断后 DNA 片段短读长测序并进行 peak calling，反映了特定 DNA 位点的蛋白结合平均状态信息。但传统方法无法获得每一个大片段 DNA 分子上蛋白结合的真实状态，无法进行 DNA 复杂结构域蛋白-DNA 交互作用分析。
本技术通过对不打断的大片段 DNA 分子进行特异性甲基化标记，利用长读长测序，获得高精度、DNA 单分子水平上的组蛋白修饰、DNA 结合蛋白序列信息，同时获得 DNA 单分子异质性、CpG 甲基化多组学、复杂结构域的蛋白-DNA 互作等信息。
该研究结果的发布，吸引了业界广泛关注，华大基因该项目第一作者瓮喆博士，为我们详细解析这项新技术。
瓮喆 博士
华大基因科技服务实验研发高级工程师，新产品业务单元负责人，发表过多篇 SCI 论文
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该研究有哪些主要成果？
本方法（BIND & MODIFY）首先构建了一种葡萄球菌蛋白 A-甲基转移酶融合蛋白（pA-M.EcoGII），将针对组蛋白修饰、DNA 结合蛋白特定抗体与细胞孵育后，pA-M.EcoGII 与特异性抗体结合。随后，激活甲基转移酶活性，将抗体结合蛋白附近的 DNA 序列中的腺嘌呤（adenine）高效率转化为 N6-methyladenosine （m6A）。最后，通过纳米孔单分子长读长测序对m6A位点进行检测，获得单分子水平的高精度蛋白-DNA 结合位点信息（图 1）。
图 1 BIND & MODIFY 技术路线流程图
进一步地，通过与传统 ChIP-seq 对标，本方法在检测组蛋白修饰 H3K27me3 水平上，具有接近的趋势、较高的相关性、以及相近的精度（图 2）。在染色质复杂结构域 pericentromeres 区域，本方法具有优于短读长测序的检验精度。
图 2 BIND & MODIFY 与传统 ChIP-seq 相比，具有高度相关性
通过分析结合位点转录起始位点（TSS）上游 1000-0bp 的 m6A 比率，本方法能够进行 DNA 分子聚类（图 3），通过 gene ontology 分析，发现异质性较高的 DNA 分子（cluster 3）与乳腺癌相关通路相关，如 VEGF singling pathway、B cell receptor signaling pathway、PD-L1 checkpoint pathway 等。本方法首次实现了单分子水平上的基于组蛋白修饰 H3K27me3 的 DNA 异质性鉴定。
图 3 BIND & MODIFY 实现 DNA 分子在蛋白-DNA 结合水平上的异质性鉴定
最终，本方法通过对大片段 DNA 分子上的蛋白-DNA 交互作用相关性进行分析，构建了反映 DNA 分子上蛋白-DNA 作用相关性的 co-labeling coefficient（CC）分析方法，以及反映分子上蛋白-DNA 作用强度的 cc index 分析方法（图 4），实现了组蛋白修饰 H3K27me3 与 DNA 结合蛋白 CTCF 在单分子水平上的远端作用相关性检测。
图 4 BIND & MODIFY 实现组蛋白修饰在 DNA 远距离上相关性鉴定
简而言之，本方法（BIND & MODIFY）是一种具有普适性、高质量、高精度的单分子水平上实现蛋白-DNA 交互作用检测的方法，该技术能够在单分子水平上为解析细胞命运决定与功能异质性的表观遗传学调控机制提供一种强有力的工具。
在测序成本不断降低的时代，本方法能够在长读长测序领域，为广大研究者提供一种新型研究方法与范式，系统实现了蛋白-DNA 交互作用信息与多组学信息的综合分析。
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该研究有哪些应用场景与展望？
BIND & MODIFY 技术在长读长测序领域，为广大研究者提供了一种新型研究方法与范式，作为传统 ChIP-seq 测序技术在单分子长读长测序领域的原创性升级，具有以下主要应用场景：
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系统性研究蛋白-DNA 交互作用在单分子水平的作用特征，发现特异性蛋白在单分子水平调控基因启动与表达的动态特征；
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定量研究蛋白-DNA 交互作用的异质性，进一步在单分子水平上精确定义细胞类群；
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联合 CpG 甲基化测序，获得 5mC 甲基化位点与蛋白-DNA 交互作用在单分子水平上的综合调控机制；
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对结构变异与蛋白-DNA 交互作用联合分析，实现边测序、边组装、同时获取基因组水平的蛋白-DNA 交互作用信息。
华大基因唐冲博士团队正在对 BIND & MODIFY 技术进行优化，针对更多与人类疾病相关的蛋白-DNA 交互作用进行系统分析，为后续新型药物靶点发现提供基础。同时，该团队也正在进行 BIND & MODIFY 技术的单分子多组学测序方案的优化升级，开发能够在同一个大片段 DNA 分子上同时进行多种组蛋白修饰、蛋白-DNA 交互作用、5mC 甲基化检测的长读长单分子多组学联合测序技术。
华大基因唐冲博士为该论文通讯作者。华大基因瓮喆博士、阮凤英、陈伟填为共同第一作者。
转自：“丁香学术”微信公众号
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