以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
炎症性肠病(IBD)是一类肠道慢性炎症，具有反复发作的特点，主要包括溃疡性结肠炎UC和克罗恩病CD两种表型，每年影响着上百万人的健康。目前，IBD的发病机制还尚未明确，但越来越多的研究表明，IBD的发病与肠道菌群失调、免疫应答紊乱、肠道屏障损伤等因素具有相关性。目前，治疗IBD的传统方法是主要使用药物，如5-氨基水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇激素或免疫抑制药来控制炎症，并服用益生菌为辅助疗法。然而，此类小分子抗炎药物代谢不稳定，且缺乏靶向，可能导致严重的药物不良反应；同时辅助给予的厌氧益生菌由于缺乏抗氧化酶，如过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)，易受到IBD中活性氧（ROS）的攻击，致使治疗效果不佳（图1）。目前需要一种更有效和更安全的方法来治疗IBD。
成果简介
浙江大学毛峥伟教授、新加坡国立大学陈小元教授和浙江大学医学院附属第二医院王伟林教授团队合作，将具有清除活性氧（ROS）能力的人工酶修饰到长双歧杆菌益生菌表面，构建了抗炎的工程益生菌（BL@B-SA50）来调节肠道炎症（图1）。其中，人工酶可以模拟天然抗氧化防御系统，快速缓解炎症症状，不仅可以取代临床使用的抗炎药物，还可以保护益生菌免受ROS的损伤而发挥其益生功能。此外，长双歧杆菌在肠道的定植特性确保了人工酶在疾病部位的持续性抗氧化治疗。该工程益生菌可以缓解肠道炎症，恢复肠道屏障功能，增加肠道菌群的丰富度和多样性，有效治疗了小鼠的UC和CD以及犬的UC，极大地加速了其临床转化进程。
人工酶武装的益生菌的构建和表征
人工酶武装的益生菌由三部分组成，分别是人工酶，益生菌和连接剂 （图2a, b）。其中人工酶，选用的是铁单原子催化剂Fe SA。因为Fe SA相对于传统纳米酶具有强抗氧化能力，可以快速有效清除ROS，保护肠道细胞和益生菌。益生菌，选用长双歧杆菌益生菌BL。因为BL不仅具有益生功能，有利于IBD修复， 同时也是益生菌中为数不多的具有肠道定植能力的细菌，可以延长其表面负载的人工酶在肠道的靶向和滞留时间，持续清除过度的ROS和炎症因子。连接剂，研究者们选用的是C18-PEG-B，其疏水端C18可以通过非共价相互作用修饰在Fe SA表面，而苯硼酸端B可以与益生菌表面的多糖发生快速简便的硼酸邻二醇反应，修饰在BL表面，不影响厌氧BL的存活率。其具体的结构表征如图2所示，可以看出Fe SA是原子分散在碳载体上的，通过C18-PEG-B修饰可以进一步黏附到BL的表面，最终形成BL@B-SA50。
人工酶武装的益生菌清除ROS
如图3所示，工程化益生菌BL@B-SA50具备类SOD、CAT活性以及天然抗氧化小分子的特性，可以高效清除IBD环境中的O2·-, H2O2, 和 •OH。修饰人工酶B-SA不仅不影响BL的增殖，还赋予其更好的抗氧化能力，提高其在ROS环境中的存活率。最终得到的BL@B-SA50可以降低结肠细胞内的ROS水平，保护结肠细胞免受炎症的损害。
人工酶武装的益生菌在胃肠道的稳定性和靶向性
口服的BL@B-SA50在到达疾病位点之前，会遭受恶劣的胃肠道环境，如胃酸、胆盐和炎症。这些因素可能会破坏人工酶的稳定性，甚至使细菌失活。由于口服的液体大概需要20min就可以快速通过胃，然后需要2h经过小肠，最后到达结肠位置，研究者们分别将未修饰的BL和工程化的BL@B-SA50在模拟胃液(SGF)中分别孵育10min和20 min, 在模拟肠液(SIF)和模拟炎性结肠液(SICF)中均分别孵育1 h和2 h，然后观察BL和BL@B-SA50的存活率以及对ROS的清除能力。如图4 a-f，经过模拟的胃肠道环境后，BL@B-SA50清除ROS的能力不仅没有发生变化，且在模拟炎性结肠液环境中表现出提高的益生菌存活率，表明BL@B-SA50具有很强的胃肠道稳定性。
随后，通过光声成像（PA）和活体荧光成像（IVIS），研究者们观察到更多的BL@B-SA50聚集在炎性肠道，表明BL可以促进B-SA的靶向（图4g，h）。此外，BL@B-SA50在肠道的长期滞留和增殖是有效恢复肠道屏障功能和肠道菌群的前提条件。因此，研究者们给UC小鼠口服相同量的BL和BL@B-SA50，并在3d后对小鼠结肠组织进行荧光原位杂交(FISH)实验，最后证实了BL确实可以长期存在结肠处，并且主要定位于结肠组织的黏液层（图4i）。同时，对小鼠结肠组织进行qPCR实验，结果显示炎性结肠部位存活的BL@B-SA50数量明显多于未修饰的BL（图4j），进一步证明了B-SA在炎性结肠部位对BL的保护作用。
人工酶武装的益生菌治疗小鼠UC
随后评估了人工酶武装的益生菌的治疗效果。首先，通过改变不同的配方和口服剂量，研究者发现口服1.25 mg/kg BL@B-SA50 是最优的治疗方案。随后，将BL@B-SA50与单一的BL、B-SA和联合的BL+B-SA疗法比较，发现BL@B-SA50表现出最好的治疗效果，同时不会引起明显的副作用。BL@B-SA50 不仅可以有效缓解肠道炎症，修复受损的肠道屏障，还可以调节肠道菌群，提高有益于IBD修复的益生菌的丰度。（图5和图6）
为了探究BL@B-SA50的临床转化潜力，研究者们进一步比较了BL@B-SA50与其他传统疗法的疗效。研究者们选用了两种传统疗法，分别是只服用抗炎药，如5-氨基水杨酸（5-ASA）、地塞米松（DEX）或甲泼尼龙（MPS）的单一疗法，和抗炎药与益生菌联用的联合疗法。结果显示，相比于临床的单一疗法和联合疗法，BL@B-SA50均显著提高了UC的治疗效果（图7），表明BL@B-SA50有望替代传统抗IBD的策略。
人工酶武装的益生菌治疗小鼠CD
为了探索BL@B-SA50的治疗范围，研究者们还评估了其对CD的治疗效果（图8）。结果显示，BL@B-SA50也可以有效治疗CD，并且不会引起明显的副作用。
人工酶武装的益生菌治疗犬UC
尽管小鼠模型在生物医学研究中被广泛使用，但由于小鼠往往不能充分代表人类状况，小鼠模型的临床转化价值存在争议。尤其，在最近的IBD临床试验中，抗IL17 /IL13/IL10候选药物的失败体现了小鼠模型的局限性。因此，使用大型动物模型验证药物的治疗效果非常重要。在大型动物模型中，犬是研究胃肠道疾病的最佳代表，因为它们的胃肠道生理机能、饮食、肠道微生物群和自发的、类似的疾病与人类相似。为了促进BL@B-SA50的临床转化，研究者们进一步评估了其在犬UC模型上的治疗效果。最后研究结果表明，BL@B-SA50可以明显治疗犬UC，并且没有表现出明显的副作用（图9）。
小结
快速缓解肠道炎症和调节失调的肠道菌群是治疗IBD的关键。然而，传统的治疗方法包括服用抗炎药和益生菌等，治疗效果不佳，并且存在潜在的危险，大大降低了患者的生活质量，增加了患结肠癌等更严重疾病的风险。本研究利用抗氧化人工酶来改造BL益生菌，快速有效地调节IBD的微环境。在该体系中，研究者们用人工酶模拟天然抗氧化防御系统，取代临床使用的抗炎药物。相较于临床药物，人工酶可以清除ROS，减轻炎症，并且具有更持久的级联催化能力，且不会引起明显的副作用。另一方面，炎症环境的缓解也提高了益生菌的生存能力，使其迅速重塑肠道屏障功能和肠道菌群。重要的是，得益于BL益生菌固有的定殖能力，人工酶在肠道的滞留时间明显延长。最终，在小鼠的UC模型中BL@B-SA50可以明显抑制ROS和炎症水平，恢复受损的肠道屏障，调节肠道微生物群。相较于临床使用的常规IBD疗法，BL@B-SA50表现出优越的治疗潜力。此外，BL@B-SA50还有效地缓解了小鼠的CD和比格犬UC症状，进一步为其临床转化提供了可能。在整个治疗过程中，均未观察到小鼠和犬的不良反应，表明BL@B-SA50具有良好的生物安全性。
本工作创新点
最近，利用合成生物学对益生菌进行基因改造使其表达抗氧化酶为治疗IBD提供了一种新的策略。然而，表达的抗氧化天然酶只有在细菌被裂解后才能释放到微环境中发挥作用，并且这些暴露到炎症微环境中的天然酶会快速失去活性，无法抑制IBD复杂且过度活跃的炎症反应。相反，研究者们的BL@B-SA50可以简单有效地缓解IBD。首先，抗氧化模拟酶B-SA分布在BL的表面可以避免对细菌的裂解，直接缓减肠道炎症。其次，B-SA具有稳定的清除多重ROS的能力，能够有效地应对复杂的IBD环境。
另外，大量研究表明抗氧化纳米酶可以替代天然酶和传统抗炎药来治疗IBD。然而，传统纳米酶催化能力弱，并且在消化道内会被快速代谢掉，削弱了其治疗IBD的效果。此外，传统纳米酶对治疗IBD的研究仅局限于对ROS和炎症的清除，其对肠道菌群的影响以及在大型动物层次的临床转化潜力尚未评估。为此，研究者们引入了高活性单原子酶B-SA以快速清除ROS，并利用益生菌BL作为载体以延长B-SA在肠道的保留时间，从而增加了纳米酶治疗IBD的效果。最终，研究者们也证实了BL@B-SA50对肠道菌群的调节能力和临床转化潜力。
除了探索上述抗氧化剂候选者之外，开发治疗型益生菌也是治疗IBD的一个热门领域。先前的研究主要是集中在使用物理涂层来保护益生菌，增强其抵抗胃肠道中酸、蛋白酶和抗生素的能力。然而，忽略了益生菌本身缺乏CAT和SOD，难以在炎症肠道生存的特性。增强益生菌对氧化压的耐受性将会提高益生菌对IBD的治疗效果，为此，研究者们将益生菌与人工抗氧化防御系统相结合，通过化学调控的策略使其能够持续、高效地清除多重ROS，增强其治疗IBD的能力。
综上所述，该研究成果为结合具有催化活性的人工酶和代谢能力的益生菌来构建新型的诊疗型“Biohybrids”提供了一种新的思路。
第一作者
曹芳芳，2019年于中国科学院长春应化所获得理学博士学位，师从任劲松研究员和曲晓刚研究员。2020年加入浙江大学毛峥伟教授课题组担任科研助理。2021年加入新加坡国立大学陈小元教授课题组进行博士后研究。现主要从事纳米酶调控微生物代谢和命运，以及多功能纳米材料在检测、成像和肿瘤代谢免疫的研究。以第一作者或共同通讯身份在Nat. Nanotechnol.; Angew. Chem. Int. Ed.; ACS Nano; Adv. Sci.; Nano Research; Chem. Commun.; Nanoscale 等本领域顶级杂志发表大量研究成果。论文被他人正面引用2097余次，H因子为16。
通讯作者
毛峥伟，浙江大学高分子科学与工程学系副主任，教授，博士生导师。作为负责人主持国家自然科学基金优秀青年项目、科技部中葡国际合作项目、浙江省杰出青年基金项目等重要科研项目。在Nat. Nanotechnol.; Nat. Commun.; Sci. Adv.; Adv. Mater.; Biomaterials等本领域顶级期刊上发表SCI论文150余篇。论文被他人正面引用8500余次，H因子为52。2019年获得中国生物材料学会生物医用高分子材料分会颁发的“青年学者优秀奖”。作为主要完成人获得浙江省自然科学一等奖（2018）和浙江省科技进步一等奖（2020）各一次。目前担任期刊Acta Biomaterialia副主编。个人主页： https://person.zju.edu.cn/maozhengwei
陈小元，1999年获得美国爱达荷大学博士学位，曾先后在Syracuse大学和Washington大学圣路易分校进行博士后研究，于2002年进入南加州大学放射学系任助理教授，2004年转入斯坦福大学，2008年升为副教授，2009年加入美国国立卫生研究院(NIH)生物医学影像及医学工程所(NIBIB)任终身资深研究员，分子影像及纳米医学实验室主任。陈教授于2020年加入新加坡国立大学医学院和工程学院，任终身Nasrat Muzayyin讲席教授。陈教授的科研方向主要涉及体外诊断，体内成像，基因/药物传输的生物材料，以及诊疗一体化等生物医学领域研究。陈教授已发表1200多篇SCI论文(H-index 172，引用率109115)，在Nat. Nanotechnol.; Nat. Rev. Mater.; Nat. Rev. Clin. Oncol.; Nat. Biomed. Eng.; Nat. Commun.; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A; Adv. Mater.; J. Am. Chem. Soc.; Angew. Chem. Int. Ed.等顶级杂志发表大量研究成果，部分研究成果已经转化并进入临床研究阶段。陈教授是Theranostics杂志的创刊主编(2022年影响因子11.6)，Acc. Chem. Res., ACS Nano, J. Nucl. Med.等多家杂志的编委，曾任中美核医学及分子影像学会(CASNMMI)主委，中美纳米医学及纳米生物技术学会(CASNN)主委，以及美国核医学及分子影像学会(SNMMI)，Radiopharmaceutical Science Council (RPSC)主委，获NIBIB Mentor Award, ACS Bioconjugate Chemistry Lecturer Award, AIMBE Fellow, SNMMI Fellow等多个荣誉。个人主页： https://www.tntchenlab.com/
王伟林，浙江大学医学院附属第二医院院长、教授、主任医师，博士生导师。入选浙江省特级专家，现任肝胆胰外科学科带头人、器官移植中心主任，浙江大学医学院副院长。享受国务院特殊津贴，是国家卫健委有突出贡献中青年专家。同时担任浙江省肝胆胰肿瘤精准诊治研究重点实验室主任，浙江省肝癌诊治技术研究中心主任，浙江省肝胆胰疾病临床医学研究中心主任，浙江大学肝胆胰疾病精准诊治创新中心主任，浙江大学外科研究所所长，中国医院协会副会长、中华医学会外科学分会常委、中华医学会器官移植学分会常委、国家卫健委加速康复外科专家委员会主任委员、中国医师协会外科医师分会快速康复外科专家委员会主任委员、浙江省医学会肿瘤外科分会候任主任委员。主持国家科技重大专项1项、973项目1项、十一五重大课题支撑计划1项、国家自然科学基金面上项目4项、卫生部重大科学研究基金1项、浙江省科技重大专项3项等课题，相关成果发表SCI论文300余篇。作为主要完成人，获得国家科技进步一等奖2项、国家科技进步二等奖1项、浙江省科技进步一等奖4项。获“白求恩式好医生”、“中国医师奖”等称号，临床及学术水平得到国内外一致认可。
转自：“NANO学术”微信公众号
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