【Analytica Chimica Acta 厦门大学李博安团队】一步式RPA-CRISPR检测核酸方法

CRISPR-Cas12a (Cpf1)被广泛应用于病原体检测。然而，大多数Cas12a核酸检测方法都受到PAM序列要求的限制。此外，预扩增和Cas12a裂解是分开的。厦门大学李博安团队开发了一种不受PAM序列限制的一步式RPA-CRISPR检测(ORCD)系统，具有高灵敏度和特异性，可提供单管、快速和视觉可观察的核酸检测。该系统同时进行Cas12a检测和RPA扩增，无需单独的预扩增和产物转移步骤，可检测到0.2 拷贝/μL的DNA和0.4 拷贝/μL的RNA。在ORCD系统中，Cas12a的活性是核酸检测的关键。具体来说，降低Cas12a活性增加了ORCD检测PAM靶标的敏感性。将该检测技术与无核酸提取方法相结合，ORCD系统可在30 min内提取、扩增和检测样本，并对82份百日咳博德特菌临床样本进行了检测，与PCR相比敏感性和特异性分别为97.30%和100%。他们团队用RT-ORCD检测了13种SARS-CoV-2样本，结果与RT–PCR一致。

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图1 LbCas12a/crRNA的顺式和反式切割靶向PAM和非PAM序列。

图3 ORCD检测系统检测PAM和非PAM靶标的敏感性

他们团队提出了一种一步式RPA(或RT-RPA)-CRISPR检测策略，通过crRNA快速、直观地检测DNA或RNA，无需PAM序列(5'-TTTN-3')。这项工作的一个关键进展是使用了一种不受PAM序列严格限制的crRNA，与针对PAM序列的crRNA相比，在30分钟内显示出类似的反式裂解活性和较低的顺式裂解活性。此外，通过LED蓝光或UV光成像，可以用肉眼观察到高反式裂解活性，因此不需要复杂的仪器。他们团队已经证明ORCD(或RT-ORCD)方法不受PAM限制，是一种快速、一步、定性的DNA或RNA可视化检测方法，显示出极高的灵敏度和单碱基特异性。此外，他们团队的简便省时和可视化结果的方法在后疫情时代POC分子诊断的未来发展中具有巨大的应用潜力。可广泛用于非专业环境下的传染病快速检测，如小型诊所、机场、田野等场所。

论文题目：Fast and visual detection of nucleic acids using a one-step RPA-CRISPR detection (ORCD) system unrestricted by the PAM

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340938

转自：“NANO学术”微信公众号

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