北京时间2023年3月31日，中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员团队在PNAS杂志发表了题为“Retrotransposon-mediated evolutionary rewiring of a pathogen response orchestrates a resistance phenotype in an insect host”的研究论文。
该研究首次揭示了由逆转座子SE2介导的遗传变异及其重塑的顺式-反式调控网络在昆虫宿主小菜蛾对Bt病原菌适应性进化过程中的关键作用。
转座子(Transposon)是一类可以在宿主基因组内自由移动的DNA元件，最早由美国诺贝尔奖得主、世界著名的遗传学家Barbara McClintock教授在玉米基因组中发现。根据转座机制，可以将转座子分为两大类：包括以长末端重复 (Long terminal repeat, LTR)和非长末端重复(non-LTR)为代表的逆转座子，这类转座子的转座依赖于“复制-粘贴”机制，RNA中间体被反转录成cDNA后被整合至基因组的其它地方；另一类是以Helitrons和末端反向重复序列(Terminal inverted repeat, TIR)等为代表的DNA转座子，这类转座子以DNA为中间体，通过“剪切-粘贴”的机制在基因组中进行移动。转座子最开始被认为是没有实际功能的“垃圾DNA序列”。事实上转座事件的发生在宿主进化过程中发挥着“双刃剑”的作用。它可以通过破坏基因结构或和重排染色体而诱发有害变异，也可以帮助宿主产生多种可以遗传的适应性表型。因此，转座子介导的遗传变异被认为是宿主表型多样性和适应性进化的主要动力，它广泛参与了宿主许多重要的生理和发育过程，特别是促进宿主对病原菌的免疫防御反应。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种革兰氏阳性昆虫病原细菌，它能产生多种杀虫蛋白，从而高效特异的杀死多种宿主昆虫。小菜蛾(Plutella xylostella)是一种世界性为害的重大农业害虫，也是世界上第一个被报道在田间对Bt病原菌产生高抗性的宿主昆虫，是研究宿主昆虫如何对抗Bt病原菌侵染的良好实验材料。之前的研究中，张友军团队发现昆虫激素含量升高激活的丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号途径可以通过不同转录因子反式调控小菜蛾多个中肠基因差异表达，最终导致宿主昆虫小菜蛾对Bt病原菌进化产生高抗性。然而，介导小菜蛾对Bt病原菌产生适应性和稳定抗性的关键遗传变异尚不明确。
本研究首先利用正向遗传学手段，鉴定出了小菜蛾对Bt病原菌抗性进化的关键遗传变异为逆转座子SE2插入导致的顺式突变。通过对Bt敏感和抗性的小菜蛾进行全基因组关联分析(Genome-wide association analysis, GWAS)和精细定位等实验发现，与Bt抗性显著关联的单核苷酸多态性(SNP)位点和插入/缺失(Indel)突变主要位于MAPK信号途径关键基因MAP4K4的上游非编码区（图1）。
图1. 图位克隆鉴定小菜蛾对抗Bt病原菌的相关遗传变异
为了进一步确定与小菜蛾Bt抗性相关的遗传变异，作者克隆并筛选到了9种敏感和5种抗性的MAP4K4基因启动子序列。双荧光素酶报告实验分析结果表明，抗性种群中MAP4K4基因的启动子活性显著高于敏感型，对主型序列进行分析发现，与敏感型相比，抗性的MAP4K4启动子中存在一个逆转座子SE2的插入，且SE2在调控抗性MAP4K4启动子活性中发挥了关键作用（图2）。
图2. Bt抗性种群中逆转座子SE2的插入导致MAP4K4基因过表达
随后，遗传连锁实验表明，逆转座子SE2的插入与小菜蛾Bt抗性表型紧密连锁（图3）。为了在小菜蛾体内直接验证SE2是否与Bt抗性相关，进一步利用CRISPR/Cas9技术在抗性小菜蛾种群中对SE2进行了敲除，结果表明，MAP4K4及下游多个中肠基因的表达量在纯合的SE2敲除种群中恢复至与敏感种群各基因表达量的类似水平，且该种群对Bt的抗性水平显著下降（图3）。以上结果表明，小菜蛾对Bt产生的高水平抗性与MAP4K4启动子中SE2的插入密切相关。
图3. 逆转座子SE2与小菜蛾Bt抗性相关
研究表明，转座子可以通过自身携带的转录因子结合位点招募转录因子以直接调控基因表达或重塑基因表达的调控网络。转录因子FOXO (Forkhead box O)属于FOX基因家族中的一个亚族，可以与规范的目标DNA响应元件“5′-RYAAAYA-3′ (R = A/G, Y = C/T)”结合，在调控昆虫的生长、发育及免疫等生理生化过程中发挥了重要作用。作者对逆转座子SE2进行分析发现，该转座子内存在一个保守的FOXO响应元件（图2）。利用双荧光素酶报告实验、电泳迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、酵母单杂交技术(Yeast one-hybrid, Y1H)和染色质免疫共沉淀-qPCR技术(Chromatin Immunoprecipitation - qPCR, ChIP-qPCR)等实验，验证了FOXO可以与SE2中保守的响应元件结合，而FOXO对敏感型MAP4K4的调控活性主要是通过与启动子中原始的响应元件结合。利用RNA技术(RNA interference, RNAi)降低抗性种群中FOXO的表达量后，靶基因MAP4K4及中肠非受体基因（APN5、APN6和ABCC1）的表达量显著下调，而受体基因（APN1、APN3a、mALP、ABCB1、ABCC2、ABCC3和ABCG1）的表达量显著上调，且干扰后的小菜蛾幼虫对Bt敏感程度显著增加（图4）。
图4. 逆转座子SE2通过招募FOXO蛋白介导MAP4K4基因过表达
作者前期研究发现，昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)含量升高及其串扰可以增加小菜蛾BtR-1抗性基因座内的MAP4K4基因的表达量进而激活MAPK信号途径，那么，FOXO在发挥对MAP4K4基因的调控活性时是否受昆虫激素调节呢？作者进一步利用免疫荧光定位(Immunofluorescence localization)等实验发现，保幼激素JH和蜕皮激素20E可以分别调控FOXO在细胞中出核和入核的命运。FOXO发挥调控活性的场所主要在细胞核内，而出核和入核的过程与FOXO的磷酸化状态密切相关，又通过免疫沉淀、磷酸化质谱分析以及蛋白磷酸化和去磷酸化的模拟实验发现，在FOXO的3个磷酸化位点中（T45、S67和S187），T45和S187是影响激素对FOXO调控MAP4K4转录活性的关键磷酸化位点（图5）。以上结果表明JH和20E可以通过改变FOXO磷酸化状态影响FOXO与逆转座子SE2的结合，从而精准调控下游MAP4K4基因的转录水平。
图5. JH和20E相互作用调节FOXO的活性
在此基础上，该研究提出了小菜蛾对Bt病原菌抗性进化过程中由逆转座子SE2这一遗传变异重塑的顺式-反式调控网络机制：位于Bt抗性关键基因MAP4K4上游启动子区逆转座子SE2的插入突变可以通过自身携带的保守转录因子结合位点招募并增强转录因子FOXO在诱导昆虫激素调节的MAPK信号中的作用，从而使小菜蛾对Bt产生稳定的高抗性（图6）。研究结果为昆虫Bt抗性分子机制阐明提供全新的视角，对田间Bt抗性监测及抗性治理具有重要的理论和实践指导意义。
图6. 逆转座子SE2介导小菜蛾对抗Bt病原菌的顺式-反式遗传调控网络
中国农业科学院蔬菜花卉研究所郭兆将研究员、郭乐博士后、白杨博士为本论文共同第一作者，郭兆将研究员和张友军研究员为论文的共同通讯作者。该研究得到国家基金优青、创新研究群体以及中国农科院科技创新工程等项目资助。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1073/pnas.2300439120
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