以下文章来源于Mol Plant植物科学 ，作者周建平
随着真核生物结构基因组学、功能基因组学的深入研究，研究者更加深刻认识到，在获取目标基因DNA序列信息基础上，对其表达活性的精确调控机制进行有效分析，是解读其在细胞分化、个体发育、性状表现中相关生物功能并进行有效应用的关键所在。真核生物基因的精准表达调控是一系列顺式作用元件（cis-acting element）与反式作用因子（trans-acting factor）相互作用的结果，其中顺式作用元件本身不编码蛋白，是基因组中一些特定DNA序列区域，与对应反式作用因子结合发挥作用。顺式作用元件包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）、沉默子（silencer）、绝缘子（insulator）等，各具特定序列构成及调控功能，其中启动子是目标基因转录调控最为直接、也最受关注的调控单元。
植物功能基因组研究中，目标基因功能缺失突变体编辑材料的获得是解读基因功能的关键因素及有效途径。同样，特定基因启动子突变体编辑材料的创制也是植物启动子位点确认、元件鉴定、功能解读等工作的必要验证体系。但现有植物启动子研究中，主要依靠天然启动子元件变异材料鉴定、大样本GWAS筛选、EMS及辐照诱变材料获取等途径，尽管此类工作在植物启动子相关功能鉴定及应用中取得了重要成果，但存在周期长、投入大、随机性强、可靠性差等缺陷。在植物启动子分离、鉴定相关基础研究及育种实践中急需快速、有效、精准的启动子定向突变体材料创制技术。
SpCas9核酸酶系统（class 2，type II，PAM为5'-NGG-3'）是目前使用最为广泛的CRISPR-Cas成员，也是目前植物启动子编辑研究工作中唯一报道的CRISPR-Cas基因组编辑工具，但SpCas9在有效编辑位点分布（偏好G-C富集序列）、编辑事件频率（1bp缺失插入编辑事件为主）、编辑特异性（3bp内碱基错配带来的非特异性编辑风险较高）、DNA切口特性（平末端切口）等方面的固有编辑属性并不能有效满足植物启动子编辑工作的有效需求，研究者迫切需要可显著提升植物启动子编辑效率、编辑事件多态性及“非沉默编辑事件”得率的高效启动子编辑工具及可行编辑策略。
2023年04月06日，电子科技大学张勇教授课题组联合扬州大学张韬教授课题组、马里兰大学Yiping Qi教授课题组，在Nature Plants杂志上发表了题为“An efficient CRISPR-Cas12a promoter editing system for crop improvement”的研究论文。该研究开发了基于多组学数据的预测模型的高效CRISPR-Cas12a植物启动子编辑系统（CAPE，CRISPR-Cas12a Promoter Editing），在可靠预测植物目标基因启动子区域关键调控位点、设计高信度向导RNA、构建多位点或单位点CRISPR-Cas12a编辑表达载体（库）基础上，实现了水稻OsGBSS1及OsGS3基因表达水平及对应农艺性状的线性可调，进而基于启动子编辑策略挖掘鉴定了绿色革命新等位基因（OsO18-PEs），为实现作物重要农艺性状数量变异从头创制提供了有效策略。全文研究工作概述如下：
1、针对植物启动子区域DNA序列及结构特性，结合启动子转录调控有效进行的细胞内部因素，该研究在整合开放染色质、转录因子结合位点、组蛋白修饰、基因组多态性、转录组等多组学数据集基础上，开发了基于多因子加权赋值策略的植物启动子关键区域、位点智能预测算法，结合Cas12a核酸酶编辑特性及植物启动子编辑多样化需求，构建了可实现植物全基因组启动子重点编辑区域或位点可信度评价、编辑工具选择、编辑位点优化等功能的高效植物基因启动子编辑CAPE系统，并提供在线基因组浏览器工具（图1）；
图1 CRISPR-Cas12a启动子编辑 (CAPE) 系统设计：a，调控基因表达的启动子区域染色质结构；b，用于构建启动子区域关键位点评估模型的基因组特征；c，基于启动子编辑策略的目标基因调控可行性；d，Cas9及Cas12a编辑系统在启动子编辑策略有效应用中的特性比较；e，基于多组学数据定量评价加权赋值算法的植物全基因组启动子重点编辑区域或位点预测及有效工具辅助设计基因组浏览器工具。
2、基于CAPE策略，针对水稻OsGBSS1、OsGS3内源基因，实现了目标基因启动子重点区域及位点的高可信度预测，并基于辅助设计的向导RNA及编辑工具选择建议，完成了OsGBSS1、OsGS3基因的有效启动子编辑工作，明显提升了启动子编辑事件总体得率、编辑事件基因型多态性，获得了一系列OsGBSS1、OsGS3基因结构完整、转录水平连续变化的启动子编辑材料，并从中鉴定了多份具实际育种价值的启动子编辑材料（图2），证实了基于CAPE系统的数量性状从头创制可行性；
图2 基于CAPE策略的水稻OsGBSS1、OsGS3內源基因启动子编辑位点设计、编辑事件基因分型及目标性状鉴定：a/f，基于评估模型的OsGBSS1、OsGS3启动子特征赋值；b/g，OsGBSS1、OsGS3启动子编辑材料（OsGBSS1-PE、OsGS3-PE）基因分型及性状鉴定；c/h，OsGBSS1、OsGS3启动子编辑材料表型变异比较；d，OsGBSS1启动子编辑预测赋值与归一化表型差异相关性分析；e，OsGBSS1启动子编辑事件获得的籽粒直链淀粉含量连续变化表型分析；i，OsGS3启动子编辑事件中基因表达水平连续变化分析及对应的粒重表型变化。
3、进一步运用CAPE系统对水稻赤霉素、油菜素内酯和独角金内酯等株型调控关键基因启动子进行编辑，发现日本晴OsD18（OsGA3ox2）基因启动子编辑材料的株高呈现连续变化，并实现了受体材料重要农艺性状的保持。进一步实验中，对粳稻高秆地方品种YBN2和BBN1进行OsD18基因启动子编辑，同样获得了具“绿色革命”特征的高产半矮秆材料。田间试验表明，遗传背景相异的日本晴和YBN2 OsD18启动子编辑系列材料均显示与绿色革命OsSD1突变体相同的农艺性状表现和抗倒伏表型。
图3 基于水稻OsD18启动子编辑的株高数量性状变异连续新种质创制：a，油菜素内酯、独脚金内酯和赤霉素合成途径及关键基因；b，基于评估模型的启动子特征赋值；c，日本晴OsD18启动子编辑（OsD18-PE）材料基因分型；d，日本晴OsD18启动子编辑材料表型变异比较；e, 日本晴OsD18-PE编辑材料植物表型分析；f, YBN2粳稻高秆地方品种OsD18基因分型；g, YBN2粳稻高秆地方品种OsD18-PE编辑材料田间抗倒伏表型分析；h, YBN2粳稻高秆地方品种OsD18-PE编辑材料产量评价。
电子科技大学周建平博士、扬州大学博士研究生刘冠卿为论文共同第一作者，电子科技大学张勇教授、扬州大学张韬教授和马里兰大学Yiping Qi博士为该研究工作通讯作者。研究工作得到了国家重大研发计划、国家自然科学基金、四川省科技项目、重庆市技术创新与应用发展项目和江苏省作物遗传学与生理学重点实验室开放基金等项目资助。
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41477-023-01384-2；https://rdcu.be/c9kFj
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