以下文章来源于南海CSG ，作者张丽萍
连接脱氧糖胺的大环内酯类抗生素是重要的药源分子，其生物合成和结构多样化通常涉及糖基转移酶和P450氧化酶在大环内酯骨架上的后修饰。有趣的是，在不同类型大环内酯类抗生素的后修饰过程中，糖基化和P450氧化具有严格的反应先后顺序(Figure 1)。例如，苦霉素生物合成途径中，先糖基化，再被P450酶PikC氧化。其内在原因是，野生型PikC对底物的识别依赖脱氧糖胺这些基团在活性口袋的“锚定结合”，因此只能催化已经糖基化的底物。这种P450酶底物识别机制导致的催化顺序限制了代谢通路的可编程性。为打破这种底物识别限制，进一步扩大PikC的底物宽泛性，并提高活性和位点选择性等催化性能，本研究设计将PikC的活性口袋关键残基突变为具有多样性功能基团的非天然氨基酸，发现PikC非天然氨基酸突变体(如PikCH238pAcF)对没有任何糖锚定基团的大环内酯底物产生了前所未有的活性，并对具有糖锚定基团的天然底物具有相较于野生型更好的活性和选择性。
Figure 1. 代表性大环内酯生物合成途径(P450酶及其引入的基团标为红色)
基于前期对P450酶PikC的底物识别和催化机制研究，研究团队推测在PikC特征识别脱氧糖胺的位点(E85、E94、F178和H238)引入大体积氨基酸可能可以部分替代脱氧糖胺的结合作用，甚至增加一些特定作用力。因此，首先利用非天然氨基酸正交翻译技术，将E85, E94, F178和H238突变成对乙酰苯丙氨酸(pAcF，Figure 2，通过串联质谱和ESI-Q-TOF-MS验证)，发现只有PikCH238pAcF可以微弱转化不带糖锚定基团的大环内酯底物6和7，并鉴定了6的产物8(C10羟化)和9(C12羟化)，以及7的产物10(C10羟化)。
Figure 2. PikCH238pAcF突变体的设计和制备
有趣的是，与野生型PikC比较，PikCH238pAcF对带糖锚定基团的天然底物4和5具有更高的活性，并对4具有更好的位点选择性(90%羟化C10位)(Figure 3)。研究人员进一步将H238突变成其余各种天然氨基酸和非天然氨基酸，发现天然氨基酸突变体H238F和H238Y活性较好，位点选择性不变，无法识别不带糖锚定基团的大环内酯底物6和7；而7种非天然氨基酸突变体中有6种可识别催化6，只有PikCH238pAcF可催化7(Figure 3)。还测定了H238F、H238Y和PikCH238pAcF的KD值，与野生型进行比较，证明这些突变增强了与特定底物的结合。
Figure 3. PikC突变体的体外功能验证
接着，研究人员解析了未结合底物及结合了6和4的PikCH238pAcF突变体晶体结构(Figure 4)，以及PikCH238pAcF突变体结合5的复合物结构(Figure 5)，并进行了7的分子对接(Figure 5)，结合已报道的PikC野生型和D50N晶体结构开展系统的比较分析。分析结果为PikCH238pAcF能够打破PikC对底物脱氧糖胺“锚定结合”的依赖，催化不带糖锚定基团的大环内酯底物6和7，并对带糖锚定基团的天然底物具有更高活性更好位点选择性这些生化特征提供了合理的解释。
Figure 4. 未结合底物及结合了6和4的PikCH238pAcF突变体晶体结构分析
Figure 5. PikCH238pAcF结合7和5的结合模式比较
最后，研究人员利用PikCH238pAcF和具有底物宽泛性的糖基转移酶BSGT-1在体外实现了人工酶级联反应(Figure 6)，获得了多种非天然大环内酯类化合物。
Figure 6. 基于PikCH238pAcF突变体构建先氧化后糖基化的大环内酯代谢通路
综上所述，本研究通过对P450酶PikC的活性口袋关键残基进行半理性非天然氨基酸突变，发现PikCH238pAcF突变体对缺乏锚定基团的底物产生了前所未有的活性，打破了苦霉素生物合成途径中先糖基化，再P450羟化的后修饰顺序，并通过晶体结构解析了PikCH238pAcF突变体的具有新活性、更高活性/选择性的分子机制，为P450酶人工改造提供了新认知。
本文通讯作者是山东大学李盛英教授和高翔教授，分别主要从事微生物天然产物生物合成与肠道微生物-宿主相互作用的分子机制研究。
文章信息: Yunjun Pan, Guobang Li, Ruxin Liu, Jiawei Guo, Yunjie Liu, Mingyu Liu, Xingwang Zhang, Luping Chi, Kangwei Xu, Ruibo Wu, Yuzhong Zhang, Yuezhong Li, Xiang Gao*, and Shengying Li* Unnatural activities and mechanistic insights of cytochrome P450 PikC gained from site-specific mutagenesis by non-canonical amino acids. Nature Communications 2023, 14, 1669.
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37288-0
本篇由张丽萍副研究员完成。
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