Science Advances | 北京大学王初/芝加哥大学赵英明合作开发了一种高效识别蛋白质修饰的工具

鸟枪法蛋白质组学已广泛应用于组蛋白标记的鉴定。传统的数据库搜索方法依赖于“目标-诱饵”策略来计算假发现率(FDR)，区分真肽谱匹配和假肽谱匹配(PMS)。该策略存在组蛋白标记数据量小导致FDR不准确的缺陷。

2023年4月5日，北京大学王初及芝加哥大学赵英明合作在Science Advances 在线发表了题为“Identification of 113 new histone marks by CHiMA, a tailored database search strategy”的研究论文，该研究开发了一种量身定制的数据库搜索策略，名为“综合组蛋白标记分析(CHiMA)”。该方法使用“50%匹配片段离子”作为识别高置信度psm的关键标准，而不是基于目标诱饵的FDR。

CHiMA在基准数据集中识别的组蛋白修饰位点是传统方法的两倍。使用CHiMA对之前的蛋白质组学数据进行重新分析，发现了113个新的组蛋白标记，用于四种类型的赖氨酸酰化，几乎是之前报道标记数量的两倍。该工具不仅为识别组蛋白修饰提供了有价值的方法，而且极大地扩展了组蛋白标记的保留库。

蛋白质翻译后修饰(PTMs)被广泛认为是一种调节蛋白质结构和功能的机制。PTM反应可以通过固有的化学反应或酶催化反应发生，这些反应使用高活性的代谢最终产物或活化的中间产物。例如，乙酰辅酶A和s -腺苷蛋氨酸可以分别被乙酰转移酶[用于赖氨酸乙酰化(Kac)]和甲基转移酶(用于赖氨酸甲基化)用作底物。L-乳酸盐，传统上被称为代谢废物，最近被发现用于修饰赖氨酸L-乳酸化，并成为赖氨酸L-乳酸化的前体，该反应最有可能通过L-乳酸辅酶A进行的。

传统的数据库搜索策略和CHiMA的工作原理图（图源自Science Advances ）

组蛋白上的PTMs，或组蛋白标记，在染色质结构和功能中起着关键作用。组蛋白PTMs的失调可导致生理变化和疾病，如癌症和神经障碍。研究组蛋白标记功能的第一步是确定哪些残基被PTMs修饰，以及组蛋白标记的变化如何与生物学结果相关。为此，用于识别和量化组蛋白标记的分析工具和试剂对表观遗传学研究至关重要。

质谱(MS)为基础的鸟枪蛋白质组学已成为识别和量化组蛋白标记的选择方法。在鸟枪蛋白质组学中，蛋白水解肽，无论是否通过修饰特异性抗体富集，都要进行液相色谱(LC) -MS /MS分析。通过将前体及其相关片段离子的质量/电荷比(m/z)与来自蛋白质库的理论值相匹配，计算方法可以确定肽序列并定位肽中的PTM位点，这一过程也称为“数据库搜索”。

在数据库搜索过程中，第一步是将实验记录的MS/MS光谱与从蛋白质数据库中获得的理论肽的硅模拟光谱相匹配。由于这一步可能会引入假阳性鉴定，区分真肽谱匹配和假肽谱匹配(PMS)是至关重要的。最常用的策略是“目标-诱饵”方法，其中使用MS/MS谱来搜索包含相等数量的“目标”(真正的蛋白质序列)和“诱饵”(通常是反向序列)的数据库。虽然目标-诱饵方法对整个蛋白质组数据是强大的，但在分析组蛋白标记时有局限性。

在识别组蛋白标记的典型管道中，组蛋白被提取和蛋白水解消化，然后进行LC-MS/MS分析。所得到的数据集相对较小，用抗PTM抗体富集后只有数百甚至数十个组蛋白肽。当使用目标-诱饵策略检查之前生成的四个数据集并应用1%的错误发现率(FDR)时，未能识别出相当大比例的组蛋白修饰位点(范围从12.5到36.4%)。由于在分析小型MS/MS数据集时，目标命中和诱饵命中的得分分布几乎相同，因此在目标诱饵搜索策略中计算一个可靠的阈值来区分积极识别和虚假识别具有挑战性。

对于这些问题，该研究开发了一种量身定制的数据库搜索策略，称为“综合组蛋白标记分析(CHiMA)”，用于识别组蛋白标记。如果在获得的MS/MS谱中观察到至少50%的预期b或y片段离子，CHiMA就会分配高可信度psm，而不是使用靶诱饵FDR。此外在数据库搜索期间，Kac、赖氨酸单甲基化(Kme1)和精氨酸单甲基化(Rme1)也包括在可能的修饰以及感兴趣的修饰。该研究对CHiMA的性能进行了基准测试，并表明这种方法可以识别两倍于传统策略的具有组蛋白标记的多肽。

使用CHiMA，该研究在检查的数据库中确定了113个以前未报道的组蛋白标记，包括赖氨酸乳酸化(Kla)、巴东尼化(Kcr)、2-羟基异丁酸化(Khib)和苯甲酰化(Kbz)。这些未报道的组蛋白标记通过合成肽的MS/MS分析得到验证。这些结果表明CHiMA可以作为一种有价值的分析工具，鉴定和表征表观遗传组蛋白标记。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf1416

转自：“iNature”微信公众号

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