JACS: 酶响应肽的自我放大装配体系

以下文章来源于纳米生物技术 ，作者池洲

南开大学的Zhilin Yu等人在Journal of the American Chemical Society上发表题为“Self-Amplifying Assembly of Peptides in Macrophages for Enhanced Inflammatory Treatment”的研究论文。由酶调节的肽原位自组装代表着一种的创新治疗药物的通用策略，但它依然受到依赖于对应的酶发生过表达这一条件的限制。本文报道了一种酶响应肽的自我放大装配系统，其由肽AmpFQ及其衍生物AmpFQ-ETGE共组装形成AmpFQB用于负载药物，与巨噬细胞中表达的NAD(P)H醌脱氢酶1 (NQO1)在巨噬细胞中建立起酶响应肽与酶表达之间的放大关系，从而在常规酶水平的活细胞中实现了酶响应肽的原位组装。该研究最终证实了酶放大组装系统通过与药物DEX联合治疗急性肺损伤的有效性，从而为抗炎治疗提供了一种新策略。

通过外部或内部的刺激，可以在活细胞中介导可控的自组装肽，从而创造出具有从疾病诊断到治疗等广泛功能的肽纳米结构，而酶由于其在催化化学中具有高度的选择性，被认为是一种调节肽自组装的通用的刺激源。目前有几种酶已经被用于操纵活细胞中的肽自组装，包括碱性磷酸酶、硝基还原酶、caspase-3/7等。然而，在多数情况下，这些酶的表达依赖于酶的自然发生，使得要精准操控特定细胞中肽的组装需要依赖于酶的过表达现象，从而导致所选用的酶类别受限，且在早期检测中受到挑战。为了实现在酶水平正常的细胞中促进肽自组装，同时保持肽的高靶向性以减小毒副作用，研究人员报告了一种与促炎巨噬细胞中酶NAD(P)H醌脱氢酶 1 (NQO1)的表达相关的肽的自我放大组装，用于增强抗炎效果。

NAD(P)H醌脱氢酶 1 (NQO1)是一种细胞溶质黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性还原酶，在抗氧化功能中发挥关键作用，能够对抗氧化应激。NQO1的细胞内水平受蛋白质核因子红细胞 2相关因子2 (Nrf2)的调节，并且通常在肿瘤细胞中上调，从而允许产生NQO1响应性前药或药物递送系统。然而，在许多生物微环境的情况下，细胞中NQO1的水平并未上调，从而限制了NQO1响应系统用于疾病治疗。这是因为在体内，Nrf2的作用受KelchECH相关蛋白1（Keap1）的调节，二者结合形成Nrf2-Keap1复合物，限制了Nrf2促进NQO1蛋白表达的作用。

在本研究中，研究组选择NQO1作为示例酶，用于创建自放大肽组装系统。为了建立这一系统，研究组设计并合成了一种醌丙酸(QPA)修饰的五肽AmpFQ及其衍生物AmpFQ–ETGE，后者包含了源自Nrf2结构域的ETGE序列，能够在体内充当与Keap1的结合配体，起到释放Nrf2从而促进NQO1表达的作用。二者以90：10的比例共组装为纳米颗AmpFQB。原则上，QPA部分能够在体内被NQO1酶还原并从肽上脱落，而QPA的释放则会导致AmpF在体内环境组装形成纳米纤维。此时，组装形成的纳米纤维具有极高的Keap1蛋白亲和力，能够与Nrf2竞争结合Keap1，使Nrf2-Keap1复合物解离，促进NQO1蛋白表达。NQO1蛋白表达量的增加，会反过来促进肽组装成纳米纤维，从而在NQO1的表达与巨噬细胞中肽的组装建立起密切的联系。

研究组在体外环境研究了QPA的NQO1响应性切割和肽AmpFQ的构象转变，通过高效液相色谱（UPLC）、CD光谱等方法证明了这种由QPA裂解引起的肽AmpFQ的NQO1响应性构象转变。此外，又通过原子力显微镜 (AFM) 和透射电子显微镜 (TEM) 表征了肽AmpFQ在QPA裂解前后形成的组件的形态。

研究组随后研究了AmpFQB在RAW264.7巨噬细胞中的组装，并阐明了组装过程与NQO1 细胞内水平之间的关系。为了研究AmpFQB和AmpFB与Keap1的关联，对游离肽ETGE、AmpFQB和AmpFB与蛋白质Keap1进行了微量热泳(MST)研究，发现无论比游离肽ETGE还是AmpFQB，AmpFB与Keap1的结合常数都有明显提高，这说明了纳米纤维的形成能够明显提高肽与Keap1的结合能力。随后，对NQO1的表达进行了WB研究，发现AmpFQB处理组的Nrf2水平明显提高。而对AmpFQ与AmpFQB处理受脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞后的bio-TEM图像中，观察到仅后者出现明显的纳米纤维。这些结果直接阐明了NQO1的表达与巨噬细胞中肽的组装之间的存在的关系。

此外，由于AmpFQB同样存在与Keap1的结合能力，为了评估AmpFQB-Keap1结合导致Nrf2上调这一伴随途径的可能性，设计了FFPFF（PF）与PF-ETGE共组装成PFB，作为对照。PFB类似于AmpFQB，具有相近的Keap1结合亲和力但不具有NQO1响应性。WB测定表明，与AmpFQB相比，用PFB处理的巨噬细胞中NQO1的水平要低得多，从而支持自放大组装途径在改善NQO1表达中的主要作用。

地塞米松(DEX)是一种人工合成、临床使用广泛的长效糖皮质激素，能够激素抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放，从而起到抗炎作用。DEX除常规的副作用外，最近的研究表明了其致使活性氧（ROS）水平升高而引起严重的副作用。对此，研究组通过上调抗氧化酶浓度降低了DEX的副作用，并通过激活Nrf2起到抑制炎症因子的作用。

研究组通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究表征了正常巨噬细胞对治疗剂的细胞摄取，AmpFQ、AmpFQB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB纳米颗粒均以相近的量被细胞摄取，且均高于ETGE，表明肽纳米颗粒提高了细胞对ETGE部分的吸收。同时研究了治疗剂对减少ROS升高和促炎因子下调的作用，CLSM及ELISA结果均证实了治疗剂的细胞内化和自放大组装系统在缓解DEX的ROS副作用和防止促炎细胞因子分泌方面的作用。

研究组通过气管内给药LPS刺激的小鼠进一步评估所得治疗剂对急性肺损伤的体内抗炎治疗效果，采用荧光标记的方法，检测并比较了AmpFQ、ETGE、AmpFQB、DEX@AmpFQ和DEX@AmpFQB的体内分布，最终证实了肽放大装配平台更高的靶向递送效率。为了直接评估治疗剂的治疗效果，通过ELISA彻底研究了支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺中与肺炎相关的促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的表达，观察到各促炎细胞因子的下调。使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为细胞内 ROS 探针，观察到ROS副作用的减轻。这些结果有力地证实了DEX@AmpFQB的抗炎作用，同时消除了DEX的ROS副作用。

结论：研究组在巨噬细胞中设计并创造了一种与酶表达相关的自我放大肽组装系统，用于增强治疗急性肺损伤的常规药物的抗炎功效。能够不依赖于酶的过表达地操控肽的自组装，并通过同时减轻 ROS 副作用和下调促炎细胞因子，增强了地塞米松的抗炎功效。与肽的靶向特性相结合，该系统将为未来精准高效地创建用于疾病诊断和治疗的超分子治疗剂提供一种独特的策略。

全文链接：

https://doi.org/10.1021/jacs.2c01323

转自：“NANO学术”微信公众号

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