导读
研究表明，中草药（HM）可能有助于治疗各种疾病。但其生物活性、作用机制、治疗靶点不明确，同时具有非特异性代谢等特点，因此HM的复杂性是药物研发进展中的主要障碍。代谢组学是克服这些问题和从小分子代谢水平了解HM的潜在工具。基于中医方证代谢组学方法以整体观点评估生物体的代谢，在了解代谢途径、评估疗效、阐明机制、发现活性成分和精准医学方面显示出巨大潜力。本文综述了HM基于代谢组学和中医方证代谢组学方法的疗效评估、活性成分筛选和靶点探索。
亮点：
1.有证据表明，中草药可以治疗各种疾病。
2.中草药化学成分的复杂性阻碍了新中草药的开发，因为其生物活性成分、作用机制、治疗靶点不明确等。
3.代谢组学已成为未来从小分子代谢水平提高和认识中草药的重要手段。
4.基于中医方证代谢组学方法的策略在了解代谢途径、评估疗效、阐明机制和发现活性成分方面显示出巨大潜力。
论文ID
原名：Efficacy evaluation, active ingredients, and multitarget exploration of herbal medicine
译名：中草药的功效评价、有效成分及多靶点探索
期刊：Trends in Endocrinology and Metabolism
IF：10.586
发表时间：2023.03
通讯作者：张爱华，王喜军
通讯作者单位：海南医学院，黑龙江中医药大学
内容
1.引言
中草药是丰富的药物来源，存在多种潜在的治疗疾病的方法，通常含有多个组分，且均具有药理作用。这些特点对HM的现代化应用提出了很大的挑战。药用植物化学成分的复杂性目前阻碍了HM新药的发展，包括不明确的生物活性物质和作用机制，不确定的治疗靶点，药物代谢的非特异性特征等。代谢组学作为中医方证代谢组学方法的核心方法在分子医学中越来越受欢迎。随着分析技术的进步，中医方证代谢组学方法能够测量生物样品中的低分子量代谢物，并为识别与特定人类疾病独特相关的代谢物以进行HM治疗提供了强有力的方法。它可以通过发现新的诊断标志物以了解疾病机制，可以促进HM的有效成分发现和多靶点探索。中医方证代谢组学方法可以作为未来在小分子代谢水平上改进和理解HM的重要工具，有助于从代谢角度解决HM的科学难题，促进活性成分的发现和开发。近年来，它被广泛应用于植物体内和体外的成分分析。在这篇综述中，我们强调了中医方证代谢组学方法在解决代谢物分析、生物标志物发现、天然产物发现、技术挑战、作用机制解释、活性成分发现以及提高其在生物医学方面的价值。本文还全面介绍了高通量代谢组学的现状、挑战和应用。
2.HM：促进疾病治疗和先导化合物发现的绝佳来源
HM为现代医学提供了大量尚未开发的资源。屠呦呦因发现和开发青蒿素而获得2015年诺贝尔奖，青蒿素是从青蒿（青蒿属植物的地上部分）中提取的一种有效抗疟药物，突出了HM对世界医学的贡献。医疗成功的关键在于疗效，几千年以来，HM一直是治疗某些疾病的有效方法。随着现代医学的发展，一些HMs的药理学研究和作用机制已经基本明确，这意味着传统医学和现代医学逐渐形成共识。例如，地奥心血康已在欧洲上市，康莱特注射液已在美国进行第3期临床研究。
HM被认为是天然的“组合化学库”，也是药物发现的绝佳来源。HM活性成分的筛选和解析对现代药物发现具有重要意义。由于化学合成药物的研发时间和成本不断增加，从HM中开发新的天然有效成分及其衍生物逐渐引起了制药商的关注。由于HM的治疗作用与生物活性成分直接相关，这些生物活性成分可以作为药物开发的先导化合物分离出来。此外，许多现代药物实际上是中草药或天然产物的衍生物。
3. 代谢组学:基因型和表型之间的联系
虽然疾病有各种遗传或表观遗传的修饰，但由于疾病机制、环境、基因环境相互作用等多种因素，与疾病相关的各种基因变异通常只占疾病风险的一小部分。代谢组学作为一种后基因组技术，寻求对生物系统内的内源性代谢物进行全面的定量评估，还考虑了遗传调控、酶动力学活性和代谢反应。小分子代谢产物位于基因和蛋白质的下游，是上游生化处理的终点，与表型关系密切。上游基因或蛋白质的改变可能导致下游代谢物的改变。因此，代谢组学反映了表型和功能的变化；它是对基因组学、转录组学和蛋白质组学的补充，是基因型和表型之间的桥梁（图1）。事实上，代谢物通常被认为是基因组学和环境之间的桥梁，反映了生物系统和环境刺激之间的相互作用功能。代谢组学描述了体内“已经发生的事情”，因此，它在早期疾病诊断中更加可靠和敏感，可以预测疾病，同时在连接基因型和表型方面发挥着重要作用。
图1 组学、环境和表型之间的相互作用。各种组学技术涵盖了不同层次的生物系统。代谢组学具有特殊的意义，因为它可以全面反映表型、环境影响和分子功能的变化，同时连接基因型和表型。
4.代谢组学：当前的技术、创新和应用
代谢组学是一门技术驱动的学科，随着分析技术的快速发展，已经在许多领域得到了有效的应用。目前，人类代谢组数据库（HMDB）描述了220945种小分子代谢物及其在生物系统中的浓度变化。大量的代谢物浓度动态范围检测对生物代谢物的全面检测提出了巨大挑战。此外，代谢物的物理和化学性质的多样性需要多种分析技术进行联合检测。目前，代谢组学研究通常基于质谱（MS）和核磁共振（NMR）平台进行（表1）。
表1 不同代谢组学平台的优缺点比较
（1）质谱（MS）
MS是代谢组学中广泛使用的一种检测技术；它具有高特异性、高灵敏度和较广泛动态范围，并易于与色谱分离平台连接。这些平台可以扩大代谢物的检测范围，为代谢物的鉴定提供更多信息。
（2）超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS）
由于生物基质的复杂性，通常需要在质谱前增加一个分离仪器，以减少离子共流出时的离子抑制现象。自从电喷雾电离（ESI）发展以来，MS和液相色谱的结合为复杂成分分析提供了更多的可能性。随着柱填充技术的进步，可以为小于2μm的颗粒提供更高的分辨率、峰值容量和更短的分析时间。UPLC-MS已成为复杂混合物分析和结构鉴定的首选方法，因为它在无需化学修饰的情况下可以检测到大量完整的代谢物。根据代谢物的化学性质，可以使用不同的色谱柱，如反相柱、离子交换柱和亲水柱。
虽然UPLC-MS具有很高的分离和定量能力，但它可能不适用于某些类别的化合物，这时就需要其他技术来帮助代谢组学进行更加全面的分析研究。例如，气相色谱-质谱和毛细管电泳-质谱等。
（3）MS成像（MSI）
组织样品中代谢物的空间定位信息无法通过传统的代谢分析技术获得。然而，不同组织中的差异细胞可能具有独特的代谢特征。随着MSI技术的出现，代谢物可以与组织或细胞的特定区域相关联，从而直接呈现分子的空间位置。此外，MSI技术可以对组织病理学染色和免疫组织化学进行补充，有助于更进一步阐明药物的作用机制。
目前存在多种MSI技术，不同的离子源与MS结合可以实现不同的空间分辨率。基质辅助激光解吸电离（MALDI）是一种与薄组织切片非常相容的离子源，是迄今为止最成熟的商业MSI技术。Kompauer等人将MALDI MSI的分辨率提高到1.4μm，这表明MALDI MSI取得了巨大进展。此外值得注意的是，MALDI MSI需要在高真空下进行，这限制了生物样品的实时应用和体内分析。解吸电喷雾电离和气流辅助解吸电喷雾电离是近年来引入和开发的MSI技术。与传统的MSI技术相比，这两种成像技术不需要复杂的样品制备、辅助电离过程和真空条件。它们以独特的方式成为药物代谢研究和临床诊断领域的实用工具。
灵敏度、空间分辨率和成像率是MSI的关键条件，这三个参数相互制约，如何平衡它们之间的关系也是困扰研究者的难题。
（4）核磁共振（NMR）
NMR是对MS的补充，它只需要一个相对简单的样品处理过程，并具有定量和高重复性的优点。此外，它是一种无损技术，非常适合研究活细胞的实时代谢。由于核磁共振可以提供代谢物结构信息，因此它被认为是鉴定未知化合物不可或缺的工具。此外，与质谱相比，核磁共振的另一个优势是它可以在不同的NMR仪器上重复；而且它的结构信息来自于化学位移，并取决于核和相邻核周围的电子数量。然而，MS的数据更多地取决于电离、质谱仪和所使用的软件。
NMR的主要限制是其相对较低的灵敏度。尽管灵敏度可以通过非常强大的超导磁体和低温探测器来提高，但浓度低于1μM的代谢物通常低于检测极限并且难以检测。为了克服这个问题，人们开发了可以提高NMR信噪比的低温探针。另一个挑战是NMR数据库的覆盖率远低于MS。目前，NMR数据库涵盖了大约2000种代谢物，而MS数据库可以覆盖20000种代谢物。相信在克服了这些缺点之后，NMR技术可以更好地服务于代谢组学，并有助于生物科学的进步。
没有一个分析平台可以鉴定和量化所有的代谢物。需要多个分析平台来扩大代谢物检测的覆盖范围。屏蔽磁体和标准处理引擎接口的出现实现了NMR和MS的串联，已被用于HM成分的分离和表征。NMR-MS平台有利于代谢组学的发展，也可能成为未来代谢组学研究中的主要技术之一。
5. 代谢组学对生物学功能和机制的解释
在对代谢物进行鉴定和定量后，解释基因、蛋白质和代谢物之间复杂的相互作用关系是代谢组学的一个重要目标。代谢物的功能注释可以提供有意义的生物信息。代谢组学可以准确地描述生物体代谢物的生化特征，有助于了解疾病所涉及的复杂生物网络的变化。代谢组学研究中的代谢物生物学功能分析和路径分析，可以通过描述相关代谢物的功能来解释目标代谢物的生物代谢途径，有利于了解其在生命系统中的生理作用（图2）。生物信息学数据库的不断发展推动了代谢组学功能和机制的完善。在HMDB中，不仅列出了代谢物的分子式和鉴定谱，还列出了浓度、生物过程、代谢酶等。KEGG将相关代谢物整合到相应的代谢途径中，并将代谢途径和代谢物可视化。数据库的不断完善促进了代谢物的鉴定，也有助于解释生物功能和潜在的机制。
图2 在代谢组学中探索中草药的研究流程。近年来，代谢组学和生物信息学领域的技术进步为中草药的研究提供了巨大的帮助。从细胞、动物模型和病人身上获得的代谢表型将有助于探索中药的作用机制、治疗目标和活性成分。
6. 功能代谢组学筛选确定新型治疗靶点
代谢组学通过监测代谢过程中转化的底物和产物，为直接测量有效物质活性提供帮助，可以更加有效地确定疾病的治疗靶点并研究作用机制。作为酶的底物和其他分子（包括蛋白质和核酸）的调节剂，代谢物含量的变化对生物作用起着决定性作用。当代谢物的含量发生明显变化时，上游的酶活性也会受到调节；这将影响到代谢途径和代谢网络。功能代谢组学筛选出的新型治疗靶点并不局限于酶、蛋白质或基因，还包括生物标志物和代谢途径。Tian等采用功能代谢组学鉴定了双酚A和四溴双酚A明显改变的内源性代谢物和基因，结合转录组学，发现大麻素受体1型（CB1R）可以通过激活CB1增加食欲并诱导肥胖，即CB1可能是诱导肥胖的新靶点。
7. 代谢组学在HM中的新作用
（1）揭开HM的秘密
HM的应用是通过数千年的人体实验发展起来的，其中包含了宝贵的生物医学信息。此外，严格编译了一些传统的HM文献，如李时珍撰写的《本草纲目》，包含1892种药物和11096个处方。近年来，传统的中医治疗方法逐渐被肯定，现代技术也被广泛用于HM的研究中。代谢组学是组学时代的一个新的驱动因素；在它的帮助下，加上现代科学研究方法，将重新诠释从传统HM中提取的古代智慧。
（2）疗效评价与分子机制探索
HM的疗效一直面临着现代医学的挑战。随着研究策略和现代化进程的加快，越来越多的研究证明了HM的疗效并阐明了其机制，这进一步巩固了HM的价值以及它与现代医学的相似之处。从HM中提取的生物活性成分一直是药用小分子物质的主要来源，比如著名的青蒿素。随着中药活性成分的不断开发和代谢组学的应用，越来越多的生物活性成分的治疗效果得到了评估，如小檗碱、黄芩苷、芍药苷、人参皂苷等。小檗碱是一种生物碱，主要从黄连（黄连干燥根茎）中分离出来；降血糖是小檗碱最主要的生物活性。Gu等人研究了受试者服用小檗碱前后的整体代谢情况，发现小檗碱可能通过降低游离脂肪酸的水平在治疗2型糖尿病（T2DM）方面发挥关键作用。除了HM的单一成分外，HM的提取物也具有很强的生物活性。例如，Shao等人利用代谢组学和微生物组学方法，评估了苦参（苦参的干燥根）的乙酸乙酯提取物对T2DM的治疗作用。研究发现，乙酸乙酯提取物可以明显改善T2DM的相关指标，抑制T2DM的进展，通过影响肠道微生物调节脂质和氨基酸代谢，从宿主-微生物代谢轴的角度阐述了T2MD的治疗机制。
HM含有多种成分，HM的单一成分或提取物可能不能反映HM多种成分的治疗效果。除了HM单一成分的降血糖作用外，单一HM如栀子（干燥栀子的成熟果实）也具有降血糖作用。Wang等人建立了高脂饮食的T2DM模型；栀子治疗后，病理症状明显改善，明显调节生物标志物，这与胆汁酸生物合成、氨基酸代谢、维生素B族代谢、牛磺酸代谢等有关，揭示了栀子对T2DM的治疗作用。然而，HM在我国临床应用中经常以方剂的形式使用，即根据中医的基本理论，将多种HM组合起来治疗疾病。当HM组合成方剂时，各HM协同发挥治疗作用，改善或预防潜在的不良反应或毒性。此外，大量的研究表明，方剂可以通过多靶点作用促进治疗。由于方剂中的大部分生物活性成分尚未确定，其作用机制也未完全阐明，因此代谢组学可能是评估方剂疗效的最佳途径。骨质疏松症是一种系统的骨骼代谢疾病，是骨折的主要风险因素。骨疏丹由淫羊藿（小檗科植物淫羊藿的干燥叶片）、蛇床子（伞形科植物蛇床的干燥成熟果实）、骨碎补（水龙骨科植物槲蕨）和丹参（唇形科植物丹参）组成，具有滋补肝肾、强身健骨、活血止痛的功效。Liu和Yuan等采用NMR和UPLC-MS对骨质疏松大鼠的尿液和血浆进行了代谢组学分析，评价了骨疏丹的疗效和机制。研究发现，骨疏丹可以通过调节能量代谢、肠道菌群、氨基酸代谢、氧化应激反应、脂质代谢、氨基酸代谢等发挥抗骨质疏松的作用。此外，本研究还首次发现了与骨质疏松症有关的新型生物标志物3-羟基丁酸和甘胆酸。因此，代谢组学的多重分析平台不仅可以解释作用机制和评价疗效，还可以发现新的与疾病相关的生物标志物。
（3）推进生物活性成分的发现
HM是活性成分发现的重要来源。在美国，FDA批准的天然来源分子实体中有25%来自植物。发现生物活性成分的经典方法通常从HM的粗提开始，然后分离成分并鉴定其生物活性。这种传统方法费时费力，而且效率低。小分子代谢物的生理作用使代谢组学领域成为制药行业许多研究人员的目标。代谢组学的出现将分析技术与计算和统计处理相结合，可以揭示HM中生物活性成分的特征和生物学功能，加速活性成分的筛选和发现过程（图2）。代谢组学不仅可以应用于整个生物活性成分发现的过程，还可以应用于药物批准后的药物监测。目前，代谢组学技术还筛选出山奈酚、桦木酸、京尼平苷等多种成分作为HM的活性成分。
（4）生物活性成分的鉴定
化合物鉴定是分析化学的核心问题，特别是在HM的研究中。只有从未知峰变为严格意义上的鉴定物质，才能充分参与和描述HM的成分、代谢物及相关研究，这也是目前HM研究的瓶颈之一。药物发现需要准确的鉴定，而代谢组学为生物活性物质的发现和鉴定提供了一个独特的框架。
目前，基于代谢组学的生物活性物质的鉴定多与多变量统计分析相结合。多变量统计分析方法中的主成分分析和正交判别分析（OPLS-DA）可以降低数据的差异，并采用Par数值处理降低峰强度，同时帮助发现更多的生物标志物。因此，可以通过OPLS-DA从大量离子中筛选出与活性相关的物质。结合MS测定的分子量，可以获得化合物的潜在组成元素，从而可以通过与在线数据库中的精确质谱和MS/MS片段比较来表征化合物。MS数据库检索是用于化合物鉴定的最快速和相对准确的方法；目前的MS数据库包含约100万个独立化合物的100-200万个光谱。此外，软件平台的开发使得化合物的鉴定更有效，特别是生物活性成分的体内代谢平台。例如，MetaboLynx和MarkerLynx是Waters MassLynx软件的插件，可帮助筛选和鉴定代谢物，并可建立多种代谢途径，如脱羧，脱乙基，葡萄糖醛酸化等。Liu等人分析了远志（远志科植物远志或卵叶远志的干燥根）的内源和外源性成分；共鉴定了35种外源成分和13种内源成分，其中10种外源成分和13种内源成分中的7种代谢物是首次鉴定。UNIFI信息平台也是一个多功能自动数据处理平台，是一个集成了数据挖掘、库检索、MS片段匹配和报告生成的简化识别过程。这种高通量分析策略近年来已被用于筛选和鉴定HM的化学成分。基于UPLC-Q-TOF-MSE结合UNIFI信息学平台应用于肝豆汤的化学成分分析，共鉴定出96种化合物，包括蒽醌类、生物碱、原三萜烷、黄酮类等。
8. 基于中医方证代谢组学的有效物质和活性化合物的发现
基于中医方证代谢组学（图3）的成功实践为发现中医疾病相关生物标志物、筛选生物活性成分、评价HM的疗效和阐明作用机制提供了科学依据。四君子汤是治疗脾气虚证的经典方剂，由人参（五加科植物人参的干燥根）、白术（白术的干燥根茎）、茯苓（茯苓的干燥硬壳）和甘草（甘草的干燥根茎）。Zhao等人采用中医方证代谢组学研究四君子汤对脾气虚证的疗效，以发现有效物质和有效成分。共有56种成分在体外被鉴定，23种化合物在体内被发现，58种生物标志物与脾气虚证有关。通过生物标志物与血清成分之间的相关性绘图分析（PCMS）人们确定了甘草苷、丙二酰人参皂苷Rb2、人参皂苷Ro、甘草次酸、2-白术内酯、去氢土莫酸、异光果甘草检酯、芒柄花素、甘草酸和 dihydroxy lanostene-triene-21-acid为有效物质，也是四君子汤的有效成分。中医方证代谢组学已被用于阐明药理作用，研究者利用非靶向代谢组学发现了64个来自渴络欣（KLX）的抗糖尿病视网膜病变生物标志物，其中51个在KLX治疗后恢复到平均水平；还发现黄芪皂苷IV（AS-IV）、大黄素、大黄酸、大黄酚为核心功效成分。研究表明，中药学为发现HMs的有效物质和活性化合物提供了一座桥梁，是HMs现代化的一个可行策略。
图3 中医方证代谢组学驱动的功效评估、活性成分鉴定和中草药多靶点探索。中医方证代谢组学作为一种有效的方法，以生物标志物与血清成分（PCM）之间的相关性分析为桥梁，将代谢组学与中药的血清药化学结合起来，从而发挥药效评价、有效成分鉴定、中药多靶点探索、生物功能和机制解释、新药开发等作用。
9. 代谢组学驱动HM面临新的挑战
代谢组学可能是最适合研究HM的方法，而在代谢组学驱动的药材研究中仍然存在挑战，如代谢物或成分的鉴定。尽管数据库已经大大增加，但对未知代谢物和中草药成分的鉴定是一个耗时和花费巨大的过程，这需要严格的程序来提高鉴定的可靠性。当一组特定的代谢物被成功鉴定，数据的生物学解释就成了一个新的挑战。因此，大力发展生物信息学将提高研究结果的可靠性，从而丰富HM生物学的解释。目前，大多数生物标志物并没有显示出明显的功能或通路关联，缺乏特异性。此外，代谢组学的数据不能共享，主要是由于生成数据的复杂性和标准化的缺乏。代谢组学研究的标准化和规范化是实现HM质量飞跃的基础。希望通过数据的标准化，使各个实验室的研究成果能够进行拟合，得出更可靠的结论，从而更有利于HM研究的现代化和国际化进程。自动化技术的发展和新策略的不断引入可以有效地改善上述问题。
结论
屠呦呦获得的诺贝尔生理医学奖为全世界提供了一个了解HM的机会。中草药成分的复杂性导致其生物活性成分的定义不明确，作用机制不清楚，主要是由于缺乏科学的研究方法，HM的价值没有得到充分的肯定。经过20多年的发展，现在中医方证代谢组学被认为是探索HM功效和阐明其作用机制的有力工具。各种研究也表明，从发现有效成分到验证先导化合物，中医方证代谢组学涵盖了药效评价。以中医药为主导的HM研究是一条漫长而繁荣的道路的开始。以代谢组学为技术核心推动HM的研究和开发，将更好地服务于公众健康。同时，希望在这个代谢组学和中医药学蓬勃发展的时代，HM能够更加清晰、透明、国际化，并得到有效的传承。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36710216/
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
