非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在排除酒精和其他明确原因的情况下，由代谢紊乱诱发肝脏出现肝细胞内脂质过度沉积的一种慢性肝病[1]。脂质在肝脏中异常聚集会导致肝脏正常生理功能受损，严重的会导致肝脏纤维化、肝硬化、肝脏坏死。2020年专家组织在共识声明中提议将非酒精性脂肪性肝病更名为代谢相关脂肪性肝病（metabolic-related fatty liver disease，MAFLD）[2]。MAFLD全球患病率持续上升，对人类健康造成严重威胁。目前，西医尚无治疗MAFLD的药物，而中医药作为我国传统医学，在治疗MAFLD方面有独特疗效，显现出巨大的优势和开发应用前景。
金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl为兰科开唇兰属的一种多年生草本植物，含有多种化学成分，包括黄酮类、多糖类、生物碱等[3]。现代研究表明，金线莲具有抗肿瘤、降血糖、保肝等药理作用[4]。近年来，金线莲及其提取物在治疗MAFLD方面体现出一定的疗效[5]。本研究运用网络药理学方法[6]探讨金线莲治疗MAFLD的作用机制，揭示金线莲防治MAFLD在靶点-通路层面的复杂分子机制，为金线莲治疗MAFLD的作用机制探究提供新思路和新方向。
1 材料
1.1动物
SPF级C57BL/6雌性小鼠，7～8周龄，体质量（20±2）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号NO.110324210105903262。动物饲养于温度22～24 ℃、相对湿度（55±5）%、12 h光暗循环的环境下，自由进食饮水。动物实验伦理批准号IACUC-2021-0008。
1.2药品与试剂
槲皮素（批号HY-18085，质量分数为98.02%）、木犀草素（批号HY-N0162，质量分数为98.49%）、小鼠巨噬细胞集落刺激因子（批号HY-P7085）购自MedChemExpress公司；DMEM培养基（批号CM10013）购自中科迈晨；Opti-MEM培养基（批号31985-070）购自美国Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自Invivogen公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批号A2383）购自美国Sigma-Aldrich公司；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗体（批号15101S）、白细胞介素-1β前体（interleukin-1β precursor，pro IL-1β）抗体（批号12242S）购自美国CST公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体（cystein-asparate protease-1 precursor，pro Caspase-1）抗体（批号AG-20B-0042）购自Adipogen公司；凋亡斑点样蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）抗体（批号sc-22514-R）购自Santa Cruz Biotechnology；IL-1β抗体（批号12703S）购自R&D systems；Lamin B抗体（批号66095-1-Ig）购自Proteintech公司；驴抗小鼠二抗（批号115-035-003）、驴抗兔二抗（批号111-035-003）、驴抗羊二抗（批号705-035-003）购自Jackson Immuno Research。
1.3仪器
3-18K型离心机（美国Sigma公司）；RX-N-C型显影胶片（广西巨星医疗器械有限公司）；JY-JX5+型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；HERAcell vios 160i型培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
2 方法
2.1金线莲活性成分筛选
从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）获取金线莲化学成分2D结构及smile式，进一步通过SwissADME数据库（http://www. swissadme.ch/）筛选出其潜在的活性成分，通过SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstarget prediction.ch/）对潜在的作用靶点进行预测，结合UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行转换。
2.2 MAFLD疾病靶点筛选
以“metabolic associated fatty liver disease”为关键词在Drugbank数据库（https://go.drugbank.com/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）及Disgenet数据库（http://www.disgenet.org）中检索得到疾病靶点，通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org）进行转换。
2.3 “活性成分-MAFLD”网络的构建
利用Venny图得到金线莲活性成分与MAFLD的交集靶点，导入Cytoscape 3.8.2软件构建“活性成分-MAFLD”网络。
2.4 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建
将交集靶点通过String 11.5数据库（https://cn. string-db.org/）构建物种为“Homo sapiens”的PPI，设定相互作用得分≥0.7，并隐藏掉游离靶点；将PPI结果从String中导出并导入Cytoscape 3.8.0软件中进行可视化分析。
2.5 基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析
通过David数据库（https://david.ncifcrf.gov/），对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，限定物种为“Homo sapiens”，其他参数默认[7]。当P＜0.05被认为具有统计学意义。
2.6细胞提取与培养
采用颈椎脱位法处死C57BL/6雌性小鼠，用75%乙醇浸泡3～5 min，从小鼠骨髓中分离小鼠骨髓巨噬细胞BMDMs，用含有胎牛血清、青霉素-链霉素和50 ng/mL小鼠巨噬细胞集落刺激因子的DMEM培养基培养。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 d，第3天补加DMEM培养基和小鼠巨噬细胞集落刺激因子[8]。
2.7细胞分组与给药
2.7.1 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路激活剂给药处理 将BMDMs以1×106个/mL接种于24孔板中，500 μL/孔，培养过夜后，用含有不同浓度（10、20、40 μmol/L）槲皮素或木犀草素的Opti-MEM培养基处理1 h，再给予50 ng/mL LPS共同处理细胞3 h；另设置不含药物的对照组和仅给予LPS处理的模型组。
2.7.2 NLRP3信号通路激活剂给药处理 将BMDMs以1×106个/mL接种于24孔板中，500 μL/孔，培养过夜后，用含50 ng/mL LPS的DMEM培养基处理细胞4 h，诱导炎症小体前体组装蛋白的表达；然后更换为含有不同浓度（10、20、40 μmol/L）木犀草素的Opti-MEM培养基处理1 h，再给予5 mmol/L ATP刺激1 h，诱导NLRP3炎症小体激活。另设置不含药物的对照组和仅给予LPS处理的模型组。
2.8 Western blotting检测上清液中IL-1β和细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达
收集各组细胞和上清液，提取蛋白[9-10]，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入相应一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗孵育1 h，加入化学发光试剂显影。
2.9统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行分析，定量数据用表示，对数据进行单因素方差分析或t检验。
3 结果
3.1 金线莲的活性成分及对应靶点
共收集到金线莲活性成分278种，通过设定的ADME条件筛选出潜在的活性成分166种，去重后获得活性成分的预测靶点557个。
3.2MAFLD的疾病靶点
从Drugbank、TTD数据库分析得到14个疾病靶点，从Disgenet数据库分析得到493个疾病靶点，整合后共得到496个疾病靶点。
3.3 “活性成分-MAFLD”网络
将166种活性成分的557个靶点与MAFLD的496个疾病靶点取交集，得到103个交集靶点（图1）。通过Cytoscape 3.8.2软件可视化分析，构建“活性成分-MAFLD”网络（图2），主要成分包括槲皮素、木犀草素、异鼠李素、山柰酚等。
3.4 PPI网络分析
通过String数据库构建金线莲活性成分与MAFLD交集靶点的PPI网络，如图3所示，共有96个节点、327条边，度值排名前10位的靶点分别为热休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、蛋白激酶1（kinase protein 1，AKT1）、信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受体α（estrogen receptor 1，ESR1）、过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、PPARA、MAPK8、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）。
3.5 GO功能和KEGG通路富集分析
GO功能富集分析涉及细胞因子、细胞增殖和凋亡的调控、血管生成等163个生物过程（biological process，BP），胞核、胞质等24种细胞组分（cell component，CC），蛋白质结合、酶结合、转录因子结合等63个分子功能（molecular function，MF）；KEGG通路富集分析涉及炎症通路、MAFLD、NLRP3通路、NF-κB通路等153条通路。选择−lgP最大的前10名做图，见图4。
3.6 槲皮素和木犀草素抑制NF-κB信号通路的激活
经典的NLRP3炎症小体组成蛋白NLRP3和pro IL-1β的表达受NF-κB信号通路调控，NF-κB参与了调控多种细胞焦亡和增殖相关因子的表达[11]。激活NF-κB继而促进NLRP3和pro IL-1β、pro IL-18的转录，可为NLRP3炎症小体的活化和发挥作用提供物质基础[12]。为了验证网络药理学方法筛选出的活性成分对NF-κB信号通路的影响，采用Western blotting检测LPS刺激的BMDMs中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β和ASC蛋白表达，如图5、6所示，槲皮素、木犀草素呈剂量相关性地抑制pro IL-1β的表达（P＜0.001），并对NLRP3蛋白表达有轻微的抑制作用，表明槲皮素、木犀草素可以抑制NF-κB信号通路的激活。
3.7 木犀草素有效抑制NLRP3炎症小体的激活
为了考察木犀草素对NLRP3炎症小体活化的影响，采用Western blotting检测LPS及ATP刺激的BMDMs上清液中IL-1β及细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达，如图7所示，木犀草素呈剂量相关性抑制BMDMs上清液中成熟IL-1β的分泌（P＜0.001），但对BMDMs中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β和ASC蛋白表达没有明显影响。
4讨论
MAFLD源自NAFLD，其发病机制尚不明确，关于MAFLD的发病机制最经典的莫过于“二次打击”学说[13]，认为其与通过多种途径及损伤之间的相互作用有关，涉及胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症浸润、细胞凋亡等过程。其中，胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱为“首次打击”[14]，导致肝细胞内脂质累积；“第二次打击”为氧化应激介导的炎性反应，导致星形细胞激活造成肝细胞纤维化。细胞凋亡和炎性反应是MAFLD发生肝纤维化、肝硬化的关键因素。NLRP3炎症小体在MAFLD、非酒精性脂肪性肝炎、肠炎、动脉粥样硬化等多种炎性疾病中发挥了重要的作用，提示NLRP3炎症小体可以作为上述疾病诊疗的干预靶点[15-17]。
目前现代医学的治疗手段主要是改善胰岛素抵抗和保肝抗炎，中药治疗通常以保肝抗炎为主[18-19]。研究显示，金线莲通过抑制脂质的过氧化、缓解血脂代谢紊乱、抗氧化应激、抗炎作用于MAFLD，与其发病机制契合。借助网络药理学的手段可有利地阐释以金线莲为例的药物治疗MAFLD的核心成分及作用机制[20]。同时，通过细胞模型，借助Western blotting验证金线莲靶向调控NLRP3炎症小体的活性成分，对阐明金线莲治疗炎性疾病的物质基础、作用机制、新药开发和质量控制具有重要的作用。
4.1 金线莲治疗MAFLD药效成分发现
结合金线莲“活性成分-MAFLD”网络分析发现，金线莲治疗MAFLD的主要活性成分是黄酮类，确认槲皮素、异鼠李素、木犀草素、山柰酚等166个活性成分，可以与103个靶点相互作用，主要通过调节脂质代谢紊乱来降低肝细胞内脂质沉积从而达到治疗MAFLD的作用。张茂华等[21]发现槲皮素能改善胰岛素抵抗，抑制脂质过氧化和影响炎症因子水平，改善肝脏脂肪化的程度。周健等[22]发现异鼠李素可通过减轻氧化应激，缓解游离脂肪酸引起的脂质沉积，提高谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性。王新等[23]发现木犀草素能够减少高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中脂质积累，并且能抑制小鼠肝脏内脂质合成的基因表达。由此可见，以槲皮素、异鼠李素、木犀草素、山柰酚为代表的活性成分在治疗MAFLD中发挥重要作用[24-25]。
4.2 金线莲治疗MAFLD关键靶点预测
本研究基于网络药理学方法揭示了金线莲可能介导关键靶点和信号通路起到治疗MAFLD的作用。PPI网络分析显示，金线莲可能通过作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2等主要靶点治疗MAFLD。靶点预测结果显示，HSP90AA1可能为MAFLD的关键靶点。SKP1的G2等位基因抑制因子（suppressor of G2 allele of SKP1，SGT1）、热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）和NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）蛋白的关联对于炎症小体激活是不可或缺的[26]，因此靶向NLRP3炎症小体或可作为上述疾病诊疗的干预靶点。
4.3 金线莲治疗MAFLD作用机制研究
KEGG通路富集分析发现，金线莲治疗MAFLD主要涉及晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE）-晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、脂质与动脉硬化、胰岛素抵抗、酒精性肝病等通路，这些通路大多与MAFLD疾病进程中的炎症浸润、脂质代谢紊乱和氧化应激反应有关，并参与MAFLD的发生发展。排名前10位的通路有3项与癌症通路相关，提示金线莲在癌症防治方面的临床应用前景，另一方面对脂肪肝进一步发展为肝硬化、肝癌有一定防治作用。
4.4 靶向NLRP3炎症小体的金线莲活性成分治疗MAFLD的生物学验证
综上所述，金线莲可能通过槲皮素、木犀草素、异鼠李素等多个活性成分，作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2等103个靶点，调控糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路等信号通路，参与调节脂质代谢紊乱、抑制氧化应激和炎症反应等过程改善MAFLD的肝损伤，发挥治疗MAFLD的作用。生物学验证结果也进一步证实了金线莲中的木犀草素、槲皮素不仅可以抑制NF-κB信号通路活化，而且还可以有效抑制NLRP3炎症小体的激活。充分体现了中药多组分、多靶点、多层次的整体调节作用，为进一步深入探讨其作用机制奠定了基础，为探索抗MAFLD的药效物质基础和作用机制提供了方向，同时为金线莲的安全性-有效性评价、质量控制、进一步开发及应用提供了科学依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：沈廷明，颜于露，叶希奇，黄春情，吴军军，方 芝，王英豪，沈悰祺，吴荔芬．基于靶向NLRP3炎症小体的金线莲治疗代谢相关脂肪性肝病活性成分发现及机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(5):1498-1505.
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