导读
复方阿胶浆(FEJ)是由阿胶(阿胶由驴皮熬制浓缩而成，ACC)、党参(党参的根部，CR)、红参(人参的根部，GRR)、山楂(山楂的成熟果实)和熟地黄(蒸干和晒干的地黄块茎，RRP) 制成的纯中药口服制剂，是一种常用的“益气养血”的方子。本研究的主要目的是结合网络药理学和代谢组学，探讨FEJ对大鼠胃癌前病变（PLGC）的潜在作用机制。本研究利用中药系统药理学和中药分子机制生物信息学分析工具鉴定FEJ的成分和潜在靶点，并将GeneCards数据库用于定义PLGC相关的靶点。我们构建了一个草药-成分-疾病-靶点网络，并进一步分析了蛋白质相互作用网络。本研究进一步使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因组途径富集分析确定了潜在的机制。此外，本研究还采用40%乙醇、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）和不规则进食的方式建立PLGC大鼠的模型。我们还通过体重、组织病理学、血常规和细胞因子水平评估了FEJ对MNNG诱导的PLGC大鼠的疗效，同时通过蛋白质印迹分析确定了预测的途径。我们采用基于超高效液相色谱-串联质谱的血清非靶向代谢组学技术来分析FEJ治疗PLGC的潜在生物标志物和相关途径。网络药理学研究表明，FEJ通过调节白蛋白（ALB）、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、TP53、AKT1等靶点发挥抗PLGC作用，其潜在通路主要涉及肿瘤相关、TNF、抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)- 蛋白激酶B(AKT)、HIF-1等信号通路。动物实验表明，FEJ可以抑制炎症、调节胃肠激素、并抑制PI3K/AKT/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号通路相关蛋白的表达。基于血清的非靶向代谢组学分析，我们确定了12种对FEJ治疗有反应的差异代谢物，代谢途径分析显示FEJ的作用集中在6种代谢途径中。基于网络药理学、动物实验和代谢组学的研究结果，我们认为FEJ可能通过调节胃肠激素和抑制炎症来改善PLGC大鼠的胃黏膜损伤，其作用机制与抑制PI3K/AKT/HIF-1α通路的过度激活和调节机体能量代谢紊乱有关。这一综合策略也为揭示中药多成分、多靶点、多途径的药效机制提供了合理的途径。
亮点：
1. 本研究应用网络药理学确定了FEJ的潜在生物活性成分，并预测其在PLGC大鼠中的代谢途径；
2. 我们通过动物实验评估了FEJ对PLGC大鼠的疗效，并通过蛋白质印迹分析验证了所预测的途径；
3. 代谢组学可用于监测FEJ干预后PLGC大鼠内源性物质的变化。
论文ID
原名：Study on the mechanism of Fufang E'jiao Jiang on precancerous lesions of gastric cancer based on network pharmacology and metabolomics
译名：基于网络药理学和代谢组学研究复方阿胶浆对胃癌癌前病变的作用机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2022.12
通讯作者：张淹，胡芳弟
通讯作者单位：国家胶类中药工程技术研究中心，应用有机化学国家重点实验室
实验设计
实验结果
1．网络药理学分析
我们从中药系统药理学（TCMSP）、中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）数据库和文献中剔除重复成分，经药物体内吸收、分布、代谢、排泄研究策略(ADME)筛选后，我们在复方阿胶浆(FEJ)中鉴定出35种成分。对于FEJ中的35种活性成分，我们通过TCMSP和UniProt数据库进一步筛选出433个蛋白靶点。
我们分别获得1228、1510、8291个与慢性胃炎、肠化生、发育不良相关的靶点。去除重复靶点后，我们最终得到了2732个相关靶点，这些靶点也可作为胃癌前病变（PLGC）的疾病靶点。我们将FEJ对应的433个靶点与疾病靶点交叉，共获得156个相同的靶点，这些靶点可作为FEJ治疗PLGC的潜在靶点(图1A)。
图1 FEJ治疗PLGC的网络药理学分析
A，针对FEJ与PLGC的维恩图；B，草药-成分-疾病靶点网络；C， PLGC与FEJ分子相互作用共同靶点的蛋白相互作用分析（PPI）结果；D，基因本体论(GO)分析；E，京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析；F，FEJ治疗PLGC的靶标途径网络。
本研究使用Cytoscape 3.9.0建立了用于拓扑分析的草药-活性成分-靶点-疾病网络的相互作用图，该图包含262个节点和618条边(图1B)。一个成分作用于一个或多个靶点，不同成分也可以作用于同一个靶点。结果表明，FEJ可能作用于多个靶点，引起复杂的药理变化。
PPI网络有156个节点，2836条边，平均度值为36.831，平均聚类系数为0.646，这反映了蛋白质之间的相互作用关系。我们使用Cytoscape 3.9.0 将PPI图可视化 (图1C)，并使用cytoNCA插件分析拓扑结构。我们通过设定Degree>64、BC > 39.74、CC > 0.55来筛选核心基因，并且总共筛选了62个核心靶点。
GO富集分析：我们将FEJ和PLGC的交叉靶点导入Metscape数据库进行GO富集分析。结果表明，GO分析中生物学过程（BP）相关的变化主要涉及341个功能注释，包括细胞迁移的正向调控、造血或淋巴器官的发育、响应氧气水平降低、凋亡信号通路等。细胞成分（CC）相关的变化主要涉及88个功能注释，主要涉及膜筏、囊泡腔、转录调节复合体、受体复合体、蛋白激酶复合体等；与分子学功能（MF）相关的变化主要涉及111个功能注释，包括激酶结合、蛋白丝氨酸或苏氨酸或酪氨酸激酶活性、细胞因子受体结合、转录因子结合、凋亡信号通路中涉及的半胱氨酸内肽酶活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合等(图1D)。
KEGG富集分析：我们将FEJ和PLGC的交叉靶点输入Metscape数据库进行通路富集分析，根据P < 0.05筛选出前20个关键通路，并绘制富集气泡图(图1E)。我们利用Cytocscape 3.9.0软件绘制前20个通路对应的靶点网络和靶点对应的成分，最终构建了“成分-靶点-通路”的网络相互作用图。黄色代表关键成分，绿色代表关键靶点，蓝色代表重要通路(图1F)。前20个通路涉及56个核心靶点和21个关键成分。综上所述，FEJ可能通过多成分、多靶点、多通路的协同调控在PLGC治疗中发挥作用。
2. 体内活性评价
2.1 FEJ治疗PLGC大鼠的药效学结果
根据组织学的评价结果，我们发现在正常对照组中，大鼠胃粘膜具有良好的弹性和规则的皱襞。而模型组在第6周时大鼠黏膜表面出现大量白色颗粒，并且黏膜层有大量的炎性细胞浸润，腺体数量减少。第8周，粘膜明显变薄，皱襞变浅且紊乱，并出现弥漫性空泡样病变，表明胃粘膜出现了肠上皮化生现象。第10周，大鼠胃壁弹性差，有增生结节，局部胃黏膜糜烂，腺体排列不规则，表现为严重的肠上皮化生和异型增生，表明大鼠已处于胃癌前病变阶段。因此，我们在第10周成功构建了PLGC大鼠模型。
接下来，根据10周的体重记录结果，我们发现与正常对照组相比，模型组的大鼠体重增长缓慢甚至略微下降。FEJ治疗组的大鼠体重始终高于模型组(图2A)。在喂养10周后，模型组的平均体重为184.4 ± 31.5 g，与FEJ治疗组的231.8 ± 47.8 g相比（图2B），相差47.4 g或20.4%（P < 0.05）。上述结果表明，FEJ能提高PLGC大鼠的体重。
图2 FEJ治疗PLGC大鼠的药效学结果
A，动物实验的重量多样性曲线；B，最终的平均体重；C，HE染色各组胃组织病理切片。结果以平均值±标准差表示。*P < 0.05 **P < 0.01表示与对照组大鼠对比的差异。#P < 0.01， ##P < 0.01表示与模型组大鼠对比的差异。
此外，组织学结果显示FEJ对N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导的PLGC大鼠有改善作用 (图2C)。正常对照组的大鼠腺体结构完整，胃黏膜形态正常，无萎缩、糜烂。模型组的大鼠胃黏膜上皮细胞严重萎缩坏死，胃黏膜变薄，腺体数量减少。FEJ治疗组胃粘膜损伤程度低于模型组，黏膜腺体轻度萎缩，黏膜上皮细胞基本完整。炎症细胞浸润明显减少。结果表明，FEJ对MNNG诱导的PLGC大鼠的胃黏膜腺体有修复作用。
最后，在癌细胞发生发展过程中，大鼠会不同程度地出现血细胞参数的异常表达。外周血淋巴细胞是肿瘤特异性免疫反应的重要组成部分，反映机体的免疫状态。如表1所示，与正常对照组相比，PLGC大鼠血清中白细胞（WBC）、红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量、淋巴细胞（W-SCC）总数显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，血小板（PLT）的数量显著升高(P < 0.01)。FEJ (5.4 mL/kg)干预后RBC数量、HGB含量、W-SCC数量显著升高，PLT数量显著降低(P < 0.05，P < 0.01)。结果表明，FEJ可改善PLGC引起的血常规变化。
表1 FEJ对PLGC大鼠血常规的影响(平均值±SD，n = 3)
*P < 0.05 **P < 0.01表示与对照组大鼠对比的差异。#P < 0.01， ##P < 0.01表示与模型组大鼠对比的差异。
2.2 FEJ对MNNG诱导的PLGC大鼠胃肠激素的影响
为了确定大鼠胃黏膜萎缩现象的存在，我们测量了血清中几种特定标记物的活性(包括PG I、PG II和GAS17)。如图3(A-D)所示，模型组PGII水平较正常对照组显著升高(P < 0.05)，胃蛋白酶原（PG）I、PG I/PGII和胃泌素17（GAS17）较正常对照组显著降低(P < 0.01)。FEJ干预后，FEJ治疗组的PGII水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，而PGI、PGI/PGII和GAS17水平显著升高(P < 0.05，P < 0.01)。
图3 FEJ对PLGC大鼠血清中(A) PG I (B) PG II (C) PG I/PG II比值(D) GAS17 (E)白介素-6 (F)白介素-1β和(G)肿瘤坏死因子-α水平的影响。结果以平均值±标准差表示。*P < 0.05 **P < 0.01表示与正常大鼠对比的差异。#P < 0.01， ##P < 0.01表示与模型大鼠对比的差异。
PG是胃黏膜主细胞分泌的胃蛋白酶前体，参与消化，包括I型和II型，两者密切相关。血清胃蛋白酶原水平可以反映胃粘膜的萎缩程度，尤其是血清PG I与胃粘膜的萎缩程度呈负相关。联合检测血清PG I和PG II可在胃黏膜“血清学活检”中发挥作用。胃肠道不仅具有储存和消化食物的功能，还能分泌一些激素，如胃泌素和生长抑素等，这些激素统称为胃肠激素。胃泌素17由胃窦中的G细胞分泌。在慢性萎缩性胃炎的情况下，由于胃粘膜萎缩引起的G细胞消失，血清中GAS17的水平显著降低。GAS17是反映胃窦粘膜损伤的重要指标。我们的研究表明，FEJ通过提高PLGC大鼠的PG I/PG II比值和GAS17水平，对大鼠胃粘膜有明显的保护作用。
2.3 FEJ对MNNG诱导的PLGC大鼠炎症细胞因子的影响
我们通过测定大鼠血清中促炎因子的表达水平（如IL-1β、IL-6和TNF-α）来评估大鼠的炎症状态。如图3(E-G)所示，与正常对照组相比，PLGC大鼠中三种细胞因子的释放水平显著增加(P < 0.01)，而FEJ可抑制PLGC大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(P < 0.01，P < 0.05)。这些结果表明FEJ能有效抑制PLGC大鼠的炎症反应。
炎症反应是导致胃黏膜损伤和胃上皮细胞癌变的主要原因。过度的炎症反应可导致体内炎症微环境的形成，这与PLGC的发生发展密切相关。本研究表明，FEJ可抑制PLGC大鼠促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的分泌，进而有效减轻胃黏膜的炎症损伤。
2.4 FEJ对MNNG诱导的PLGC大鼠蛋白质表达的影响
根据网络药理学分析结果，FEJ的重要通路涉及肿瘤通路、PI3K-AKT、HIF-1信号通路等。缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)参与细胞对缺氧的反应。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路作为HIF-1α的上游调节因子，在癌细胞中被异常激活，从而增强细胞对缺氧和营养不良的耐受性。因此，我们进一步评估了FEJ调节PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的能力。
如图4所示，与正常对照组相比，PLGC大鼠的PI3K、p-AKT/AKT和HIF-1α的水平显著上调(P < 0.01，P < 0.05)，但PI3K、p-AKT和HIF-1α的水平在FEJ给药后显著下降(P < 0.01，P < 0.05)。这些结果表明，FEJ可以抑制PLGC大鼠PI3K/AKT/HIF-1α通路的异常激活。
图4 FEJ对PLGC大鼠PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的影响
A，PLGC大鼠胃组织中PI3K、p-AKT/AKT和HIF-1α蛋白表达的蛋白质印迹分析；B、C和D， PI3K、p-AKT/AKT和HIF-1α蛋白表达的定量结果（基于Image J软件）。结果以平均值±标准差表示。*P < 0.05 **P < 0.01表示与正常大鼠对比的差异。#P < 0.01， ##P < 0.01表示与模型大鼠对比的差异。
过度磷酸化的AKT (p-AKT)参与慢性萎缩性胃炎的发病机制，并可导致胃肿瘤细胞的代谢失调。研究表明，PLGC的发展伴随着过度的炎症反应、氧化损伤和肿瘤细胞的异常增殖，这些过程需要消耗大量的能量，并导致组织供氧不足。HIF-1α是缺氧反应中最关键的核转录调节因子。它在缺氧条件下被激活，并参与细胞增殖、凋亡、分化、血管生成和能量代谢。作为HIF-1α的上游调节因子，PI3K/AKT信号通路在各种人类癌症中被频繁激活。当正常细胞缺氧时，PI3K/AKT信号通路受到抑制，这促进了细胞凋亡并加剧了细胞损害，同时影响了线粒体途径凋亡过程中Bcl-2蛋白家族的活性。缺氧刺激癌前病变和癌细胞也可导致PI3K/AKT信号通路的异常激活，并阻断异常细胞的凋亡。因此，抑制PI3K/AKT/HIF-1α信号通路可能是阻断胃癌前病变向胃癌恶性转化的潜在途径。
3. FEJ调节MNNG诱导的PLGC大鼠血清代谢物
3.1 总离子流色谱图
每组大鼠质控样品（QC）和血清样品的总离子流色谱图峰形分离度好，组间重叠好，基线稳定，表明该实验条件可实现血清中物质的快速分离，适用于大鼠内源性物质的检测。
3.2 多元统计分析和生物标志物筛选
我们分别在负离子和正离子模式下通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘方判别分析（OPLS-DA）分析血清代谢物。PCA得分图(图5A和B)显示，对照组和模型组可以在正离子模式和负离子模式中明显分离，而FEJ治疗组介于两者之间，说明PLGC大鼠血清代谢物发生了明显变化，且FEJ (5.4 mL/kg)有一定的调节作用。
图5 通过多变量分析不同组的代谢特征和差异
(A)负离子模式和(B)正离子模式下的PCA得分图；(C)负离子和(D)正离子模式下正常组和模型组之间的OPLS-DA得分图，(E)负离子和(F)正离子模式下模型组和模型+ FEJ治疗组之间的OPLS-DA得分图；(G)负离子和(H)正离子模式下正常与模型组之间，以及(I)负离子和(J)正离子模式下模型与模型+ FEJ治疗组之间的OPLS-DA火山图；(K)负离子和(L)正离子模式下的正常和模型组之间，以及在(M)负离子和(N)正离子模式下的模型和模型+ FEJ治疗组之间的OPLS-DA模型的统计验证。
OPLS-DA得分图(图5C、D、E、F)显示，在正离子和负离子模式下，正常对照组与模型组、模型组与FEJ治疗组之间存在显著差异。在负离子模式下，正常对照组与模型组的R2X、R2Y、Q2分别为(0.619、0.987、0.868)(图5C)，正离子模式下的R2X、R2Y、Q2分别为(0.751、0.968、0.713)(图5D)；在负离子模式下，模型组与FEJ治疗组的R2X、R2Y、Q2分别为(0.962、0.992、0.946)(图5E)，正离子模式下的R2X、R2Y、Q2分别为(0.741、0.917、0.691)(图5F)。为验证模型的可靠性，我们进行了200次排列试验，发现R2和Q2值均低于初始值，说明模型具有较高的稳定性和较好的预测能力(图5K、L、M、N)。上述结果表明，FEJ可以显著调节PLGC大鼠血清代谢物的组成。
我们以投影变量重要性值（VIP）>1和倍数变化（FC）值> 1.5或FC值<0.067作为非靶向代谢组学分析的差异变量筛选标准。图5G、H、I和K为代谢物上调或下调表达的火山图；每个点代表一个代谢物，红色部分代表显著上调的代谢物，蓝色部分代表显著下调的代谢物。负离子模式下，与正常对照组相比，我们在模型组中分别鉴定出93个上调代谢物，78个下调代谢物，42个上调代谢物；正离子模式下，我们鉴定出35个下调代谢物，这些代谢物可作为PLGC发展的通路背景网络(图5G和H)。在负离子模式下，与模型组相比，我们在FEJ治疗组鉴定出5个上调代谢物，26个下调代谢物；我们在正离子模式下分别鉴定出7个上调代谢物，55个下调代谢物，这些代谢物可作为FEJ治疗后发生变化的差异代谢物(图I和J)。我们在两组间共获得71个重叠的差异代谢物。我们利用KEGG和人类代谢组数据库(HMDB)对这71种差异代谢物进行初步注释，共获得12种关键差异代谢物信息，包括牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、四氢皮质醇、甲基丙二酸、去氧胆酸、4-乙酰氨基丁酸、3a,6b,7b-三羟基-5b-胆烷酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨胆酸、苯乙酰甘氨酸、3-羟基丁酸。
3.3 通路富集分析
基于血清中生物标志物的数据，我们绘制了包含聚类结果的热图(图6A)，该图可以直观地观察不同组之间代谢过程的差异。为了探索各种生物标志物的可能途径，我们使用MetaboAnalyst 4.0来富集代谢物。结果表明，FEJ可通过多种代谢途径缓解PLGC大鼠的症状，这些途径分别是初级胆汁酸生物合成、酮体的合成和降解、牛磺酸和次牛磺酸代谢、丁酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(图6B)。
图6 FEJ改善PLGC的相关途径分析
A，差异代谢物的聚类分析热图；B，血清代谢途径。
胆汁酸(BAs)是消化液的重要成分，在脂肪代谢中发挥重要作用。BAs反流进入上消化道，引起肠道代谢紊乱，以及在胆管内沉积，可能参与胃肠道肿瘤的发生发展。胆汁反流性胃炎与人和动物的胃炎和胃癌的发生有关。
酮体是由肝脏产生的脂质衍生分子，通过循环代谢分布在活性组织中，在禁食或长时间运动时充当循环能源。
牛磺酸与胆汁酸结合形成牛磺胆酸，这是消化道吸收脂质所必需的代谢途径。牛磺胆酸已被证明可以通过抑制中性粒细胞活化和脂质过氧化来改善吲哚美辛引起的胃粘膜损伤。
丁酸已被证明可以改善肠道屏障完整性、抗炎、诱导自噬、调节肠道微生物群失调、维持厌氧微环境，并促进肠-肝轴的能量代谢。缺氧诱导因子-1 (HIF-1)是一种协调屏障保护的转录因子，由丁酸调控，在HIF-1存在的情况下促进紧密连接蛋白的表达，从而诱导屏障功能的形成。
精氨酸和脯氨酸的代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解均为氨基酸代谢。研究表明脯氨酸可以清除自由基，精氨酸可以通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来抑制氧化应激反应。结果表明，氨基酸作为能量代谢的物质基础，参与了胃粘膜癌变的发生。上述通路均与能量代谢通路相关，说明FEJ可以逆转被PLGC中断的与能量代谢相关的生物通路。这些结果表明，FEJ对胃癌癌前病变的作用主要与调节能量代谢有关。
结论
综上所述，网络药理学结合药理学实验和血清代谢组学研究表明，FEJ可通过减轻炎症反应和改善胃肠激素来改善PLGC大鼠胃黏膜损伤，其机制主要与整体调节PI3K/AKT/HIF-1α信号通路相关蛋白表达有关，而FEJ对PLGC的改善作用可能也与能量代谢的调节有关。FEJ对PLGC具有多成分、多靶点、多通路的干预效应。FEJ的潜在机理如图7所示。然而，人们需要更多的临床试验来进一步证实这些结论。
图7 FEJ改善PLGC的潜在机制
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36563889/
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