RNA研究利器！诺奖团队揭示靶向RNA能实现基因敲低 的高效新型基因编辑工具

RNA定向敲低 (Knock Down, KD) ，这一技术的巨大优势在于其在对 DNA 不造成永久改变的情况下，在RNA水平实现对靶标基因定向调控，其在基础研究和医学治疗等领域具有不可估量的价值。可惜的是，现有方法如CRISPR/Cas13, RNAi等存在着编辑效率低、脱靶率高或者打靶区间受限等，因此在哺乳动物细胞中实现精准、高效的RNA定向转录调控仍然是一项艰巨的挑战。

2023年1月23日，美国加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系诺贝尔奖获得者Jennifer Doudna课题组在Nature Biotechnology期刊上发表了题为“Precise transcript targeting by CRISPR-Csm complexes”的研究论文，基于III型CRISPR-Cas系统开发出名为CRISPR/Csm 的基因编辑定向调控系统。研究通过将 III 型系统CRISPR/Csm引入真核生物中，证明来自嗜热链球菌的 III-A 型 Csm 复合物可作为一种高效的RNA 敲低工具，其编辑范围广泛，脱靶率低，这一精准且多功能的 RNA 编辑技术对体内 RNA 诊断、筛选和合成生物学的发展等具有重要意义。

CRISPR/Csm是一个来源于原核生物的独立系统，作为多亚基Csm复合物，包含五个不同的亚基 ( Csm1-5 ) ，依赖于额外的蛋白质 Cas6来处理前体crRNA。与 RNAi 不同，它不仅适用于细胞质，还适用于细胞核，可以定位于细胞核并用于靶向核内非编码 RNA 和 pre-mRNA。与Cas13相比，Csm仅在crRNA的靶互补区内的进行顺式切割，不会受到反式切割活性的影响。此外，CRISPR/Csm的编辑不会优先发生在特定的nt碱基（例如U），也不直接受到目标侧翼序列的影响。

图1. III 型 CRISPR-Cas 系统

作者选择了不同表达丰度的三种核非编码 RNA（XIST、MALAT1 和 NEAT1）和八种细胞质 mRNA（BRCA1、TARDBP、SMARCA1、CKB、ENO1、MECP2、UBE3A 和 SMAD4）作为靶标基因来验证靶向内源性转录物时其 RNA的敲低效率。与其他靶向RNA的CRISPR/Cas系统一样，CRISPR/Csm系统对靶点选择没有任何PAM要求，32 nt的crRNA可以产生了最高的敲低效率（长度≤28 nt几乎没有编辑，≥36 nt编辑效率不断降低）。为检测编辑效率，作者利用一体化载体转染 HEK293T 细胞48 小时后， FACS 分离转染（RFP 阳性）细胞并提取总细胞 RNA 后通过RT-qPCR 来测定 RNA 敲低水平。结果表明，与对照相比，CRISPR/Csm每个靶标的三个crRNA中至少有一个产生>90%的KD编辑。其中三种具有生物学意义的核ncRNA（XIST，MALAT1和NEAT1）实现>95%的KD。众所周知，核RNA难以KD，通常需要昂贵的化学修饰反义寡核苷酸来指导RNase H介导的切割。这一结果表明，Csm作为一种高度稳健、高效的RNA KD工具，不仅适用于细胞质，还适用于细胞核。

图2. 内源性转录物实现精准高效编辑

作者利用 RNA-seq来检测 CRISPR/Csm系统的脱靶效应，将Cas13（RfxCas13d）和RNAi作为对照。KD 进行 48 小时后，通过 FACS 富集转染的细胞并测序。结果显示，比较 Csm 的非靶向 crRNA 和空载体 (EV) 对照样本之间转录水平的散点图，显示几乎没有上调或下调的转录物,CRISPR/Csm介导的RNA KD 在人类细胞中表现出最小的脱靶效应，这表明 Csm 表达本身不会显着扰乱细胞环境。与 Cas13 不相比，其介导的 KD 在细胞中产生的毒性最小。

     图3. CRISPR/Csm具有最小脱靶效应和细胞毒性

最后，作者发现基于催化灭活的CRISPR/Csm系统，通过将GFP融合到Csm3亚基上，能够实现多价成像显示（每个复合物≥3x GFP），可用于活细胞RNA可视化。这可能比Cas13等单亚基效应器具有独特的优势。除了GFP之外，其他感兴趣的蛋白质可以融合到各种Csm亚基上。此外，催化失活的CRISPR/Csm也可用于破坏RNA结构基序或RNA-蛋白质相互作用，而无需在DNA水平上进行操作。作为一种多亚基复合物的CRISPR/Csm在RNA水平上存在着巨大的应用优势。

图4. 基于CRISPR/Csm的活细胞 RNA 成像

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01649-9

来源：植物生物技术Pbj

转自：“iPlants”微信公众号

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