每一年，从基金评审结果放榜开始，到下一年的基金提交，孤勇的基金申请人有半年的时间都在进行基金申请准备工作。基金申请中科研基础、撰写的专业水平固然重要，同时，研究方向的选择，有时候也能发挥重要的作用。
很多评审专家并不一定是全能的专家，给他一个不熟悉或者并非他专业领域的本子，可能不太容易给专家引起“共鸣”。因此，适当在撰写本子和选择方向时，让受众一目了然就显得至关重要。比如一个很细节的技术，或者是从热点出发、结合热点做研究。
今天分享一篇2022年5月吉林大学白求恩第一学院张文艳团队发表在微生物领域的中科院一区杂志mBIO上的论文。尽管mBIO影响因子不到10，但妥妥的Top杂志，国人一年在这个杂质上发表的文章数量可能没有在CNS上发表的多。
原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.01300-22
从题目“去泛素酶USP29能够阻止SARS-CoV-2病毒的ORF9b蛋白降解而促进病毒的毒力”，可以看出这篇文章有两个研究热点：一个是蛋白的泛素化修饰；另外一个是SARS-CoV-2。有这两个关键词的存在，几乎让所有读者（评审专家）都能迅速获得关键信息，容易代入。
一旦题目清晰，背景（立项依据）写起来就比较轻松了。这两个热点加持的研究方向本身不需要过多介绍，因为读者很容易理解，阻止病毒蛋白的降解可能会促进病毒的毒力。因此，在介绍背景的时候，只需要介绍主角分子USP29在调控泛素化中的作用及涉及的核心（调控病毒复制），再对病毒蛋白ORF9b的作用进行科普。如果有（前期基础）证明ORF9b有被泛素修饰的结果，那就妥妥的“研究假设成立”。
主要研究结果如下：
（1）ORF9b可以通过蛋白酶体途径泛素化降解
对病毒蛋白单独进行泛素化检测后发现，ORF9b能够被泛素化修饰（图1D），而ORF3却没有被显著泛素化修饰(图1E)。
图 1 ORF9b能够被泛素化修饰
（2）USP29作为DUB（去泛素酶）防止ORF9b降解
哪些去泛素化蛋白能够调控ORF9b的泛素化呢？作者也不确定，于是作者对常见的USP系列蛋白进行筛选。在co-IP实验中，发现仅有USP29降低了ORF9b的泛素化程度（图2B），敲低USP29后ORF9b的去泛素化减少，并且ORF9b的表达也减少（图2C），此外还发现ORF9b可以在K48和K63残基处被泛素化（图2D）。
图 2 USP29通过泛素化阻止OPF9b降解
（3）USP29的C端对ORF9b去泛素化至关重要
每个蛋白都有一个活性结构域，USP29也是如此。为了找到USP29发挥功能的关键结构域（位点），作者通过构建突变体载体的办法进行验证。结果显示突变USP29的C端位点（C294A）后失去了泛素化ORF9b的能力（图3A）。除了关键位点外，在C端的肽酶结构域也能够影响ORF9b的泛素化（图3D）。
图 3 ORF9b去泛素化依赖于USP29的酶活以及C端
（4）病毒蛋白ORF9b被泛素化的位点
既然找到USP29上发挥作用的关键位点了，那病毒蛋白ORF9b上哪个位点决定其被泛素化修饰呢？作者将病毒蛋白ORF9b进行结构拆分并构建成载体，尝试找到ORF9b上被修饰的位点（图4A）。找到影响ORF9b被修饰的结构域后，进一步找ORF9b上被修饰的氨基酸（图4C），最终验证出K4R和K40R两个关键位点（图4D-E）。
图 4 ORF9b被泛素化修饰的位点
（5）USP29增强ORF9b介导的I型干扰素和NF-κB抑制
做完了分子机制，是不是该研究下这些工作“有啥用”？紧接着，作者开始阐述这一相互调控对病毒和细胞互作过程的影响。因为病毒蛋白ORF9b是可以抑制细胞抗病毒反应的，作者检测到USP29 的过表达增加了 ORF9b 的表达，导致比单独的 ORF9b 更强的 IFN-β 和 NF-κB 抑制能力（图5A-B）；敲低则出现相反的结果（图5G-H）。
图 5 USP29通过增加ORF9b的表达来增强ORF9b介导的IFN和NF-κB抑制
（6）USP29增加了病毒的毒力
前面这些工作其实还是偏向于机制，作者最后一部分放在了引起的“现象”上，即USP29作为一个细胞的蛋白，间接增加了病毒的毒力。做法也不难，就是检测USP29的含量高低能否影响病毒复制（复制量越大，一定意义上破坏越大，病毒毒力相对增大），作者在这里设置了一个VSV的对照，特别强调USP29对病毒复制（毒力）的促进作用（图6-7）。
图 6 USP29通过稳定ORF9b来增加VSV病毒毒力
图 7 USP29通过稳定ORF9b增加SARS-CoV-2trVLP传染性
小结
整篇文章思路不复杂，都是常规的实验，数据量不大，但是较为完整，发到一个TOP期刊还是很赚的。
如果以国自然的格式去看这个文章也比较符合申请青年基金的标准。研究内容可以留下“寻找蛋白关键位点”和“调控细胞IFN和NF-κB的机制”两项内容，其它的部分作为“前期基础”。相信能写出一个至少“2个A”的本子。
转自：“学术查”微信公众号
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