血管生成是利用现有的血管通过细胞增殖和出芽形成新生血管的过程，该过程涉及多种细胞和分子。血管生成是肿瘤浸润和转移必经的过程和生物学标志，因此成为了潜在的治疗靶点。运用抗血管生成疗法，在医学上可用来治疗癌症和恶性肿瘤。近年来血管生成的研究热度呈整体上升的趋势。
2022年9月8日，来自丹佛大学的Kushner团队在Nature Communications（IF: 17.694)上发表了题为Rab35 governs apicobasal polarity through regulation of actin dynamics during sprouting angiogenesis的文章，该文章描述了Rab35在血管生成中的作用，提供了Rab35作为肌动蛋白组装调节器的实验证据。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.12.
研究内容
在早期血管发育中，转运途径（如使用Rab GTP酶的途径）的任务是以高时空精度来运送囊泡中的“货物”。许多RAB运输蛋白在内皮组织中的功能仍不明确，与血管发育的相关性尚不清楚。在这项研究中，该研究团队采取了一种整体的方法来研究Rab35在体外和体内对萌发行为和下游细胞形态动力学的影响。运用3D出芽实验，聚焦于Rab35效应器和基因编辑技术，系统展示了Rab35在血管发育过程中调控肌动蛋白重塑的作用。
1.RAB35是萌发血管生成所必需的
Rab35在内皮细胞出芽中表现出强烈的膜定位，siRNA敲除Rab35使芽长和芽数减少，非腔化芽的百分比明显增加且芽显得粗壮、无腔隙、普遍不成形。对细胞骨架、顶端和基底标记物进行染色，成像结果表明Rab35基因下调影响了所有蛋白质的定位，Rab35的丧失会全面扰乱细胞极性程序。因此，Rab35在血管生成出芽期间建立细胞极性方面发挥了重要作用。
图1 Rab35是是芽形成所必需的
2. Rab35在萌发过程中驻留在顶膜
新芽中不同细胞区间的Rab35富集程度显示，WT和CA型Rab35偏向于顶端膜，而DN型Rab35驻留在细胞质中。WT和CA Rab35的亚细胞成像显示与顶端Podocalyin有很强的共存，而DN Rab35的表达产生了极性缺陷。因此Rab35在很大程度上以其活性形式定位于顶端膜，以及高肌动蛋白密度的区域。
图2 Rab35在内皮出芽中的定位
3. Rab35与血管内皮细胞内ACAP2相互作用
通过Rab35效应器(ACAP2、Rusc2、OCRL、MICAL-L1、MICAL-1和Fascin)进行功能筛查。Rusc2水平在ECs中检测不到首先被排除。单敲除ACAP2、OCRL、MICAL-L1、MICAL-1和Fascin表现出与Rab35敲除相似。除MICAL-L1，所有蛋白质都使非腔化芽的频率升高，并有不同程度的肌动蛋白紊乱。双重敲除任何效应物都明显促进管腔缺陷。但只有ACAP2和Fascin与Rab35在质膜上显示出强烈共定位。WT和CA型的Tom20-Rab35与ACAP2的共表达显示了在线粒体的共定位，而DN型Rab35没有显示与ACAP2的结合，与其他四种效应器的共表达在线粒体没有显示任何共定位。这些结果共同表明，在内皮组织中只有ACAP2与Rab35直接相互作用。
图3 ACAP2与Rab35结合
4. Rab35激活血管内皮细胞Arf6活性
在这部分中，研究人员首先确定Arf6在培养中相对于Rab35和ACAP2的定位，发现ACAP2不直接作用于Arf6，或者这种信号转导不需要在ECs中有很强的结合作用。接着，研究团队从生化上证明Rab35的缺失增加了非内皮组织中Arf6的活性，发现由于Rab35的丢失而过度激活Arf6可能不是导致萌发缺陷的原因。进一步研究Arf6以确定如何影响出芽，结果表明Rab35和Arf6的定位行为在血管生成过程中可能没有功能上的联系。
图3 ACAP2与Rab35结合
5. Rab35功能需要DENNd1c
Rab35有三个GEFs，DENNd1a-c。DENNd1c不参与GTP水解，但具有与球状和丝状肌动蛋白结合的能力。DENNd1a/b的敲除没有对出芽形态产生明显影响,但单敲除DENNd1c会导致生长畸形，反映Rab35功能的丧失。敲除所有DENNd1对出芽行为产生最大影响。敲除任何一个DENNd1不会导致其余DENNd1表达补偿性增加。与DENNd1a/b相比，DENNd1c敲除后表现出顶端质膜积累的最大增加。这些数据表明，DENNd1c的丢失表征了Rab35敲除对出芽和肌动蛋白细胞骨架的影响。
图4 萌发和Rab35功能需要DENNd1c
6. Rab35和DENNd1c定位于肌动蛋白聚合位点
用CK-666处理细胞后迅速耗尽细胞皮质的肌动蛋白，给药前Rab35在质膜上表现出均匀分布并在肌动蛋白的部位富集，给药后成为分散在细胞质中的离散点。用同样方法观察到DENNd1c在皮质肌动蛋白上高度富集，但给药之后耗尽，CK-666处理将DENNd1c重分配到未受影响的肌动蛋白上，这表明Rab35和DENNd1c 被招募到肌动蛋白丝上。敲除DENNd1c后Rab35定位能力明显下降，Rab35定位到皮质Arp2的能力显著减少。这部分研究表明Rab35被快速地招募到肌动蛋白皮层并被DENNd1c锚定。
图5 Rab35定位于皮质肌动蛋白
7. Rab35调控肌动蛋白组装
将WT，CA和DN型Rab35导入自由迁移的内皮细胞，发现CA型Rab35显著增加了细胞的突起和收缩能力。分离G-和F-肌动蛋白，发现Rab35基因敲除后G-肌动蛋白比例显著增加。用GC球蛋白和鬼笔环肽进行染色，发现当Rab35缺失，G/F-肌动蛋白的比例显著增加。当表达Rab35时对G/F肌动蛋白进行共染色，验证了Rab35与两个肌动蛋白群体共定位。这一数据表明，Rab35的缺失与细胞G-肌动蛋白的升高有关。使用SEM观察也表明，Rab35与调节肌动蛋白组装的局部位置有关。
图6 Rab35调控肌动蛋白动力学
8. Rab35基因缺失促进慢性细胞骨架重排
Rac1介导分支肌动蛋白聚合，而RhoA介导肌动蛋白应激纤维的组装。没有Rab35的情况下，rac1和RhoA的活性都上升，失去Rab35会降低肌动蛋白聚合。这表明Rab35的丢失促进了慢性肌动蛋白重排。用Rac1和RhoA抑制剂及激活剂的组合来处理细胞。RhoA过度激活使细胞G-肌动蛋白升高，而Rac1并不影响G-/F-肌动蛋白比率，表明Rab35功能的丧失可能由于RhoA活性的增加而使肌动蛋白偏向球状。进一步研究表明Rac1的异常活性可能是导致慢性肌动蛋白重塑和广泛性芽体畸形的潜在机制。
图7 Rab35基因缺失促进慢性肌动蛋白重塑
9. Rab35在斑马鱼的血管发育不可或缺
用CRISPR/Cas9基因编辑在斑马鱼中进行Rab35基因敲除，研究人员瞄准了Rab35的两个同源物，Rab35A和Rab35B。双敲除使胚胎致死，表明Rab35对正常的胚胎发育至关重要。Rab35A/B基因敲除组与对照组相比肌动蛋白聚集显著增加。DN 型Rab35的血管过表达或CK-666处理也促进了异常Rab35积聚的增加。将注射Rab35A/B CRISPR的细胞转移到WT宿主产生的体间血管(ISV)中，发现Rab35A/B缺失的ISV是畸形的，其特征为外观薄且无管腔。结果表明，Rab35是生物体存活和体内肌动蛋白动态平衡所必需的。
图8 Rab35在斑马鱼的血管发育不可或缺
结论
总体而言，该研究强调了Rab35在体外和体内血管形成过程中调节肌动蛋白动力学的功能，有助于了解内皮细胞如何通过整合细胞自主和集体细胞信号来协调血管形成。
转自：“学术查”微信公众号
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