医学研究论文经常爆出学术不端，甚至整个科室、整个医院集体沦陷，令人惋惜。这些实验多以非编码RNA为研究对象，将一个基因的功能做成了灵丹妙药，滑稽的不行。很多验证性的结果就是“几个柱状图”、“几条WB条带”加上几个似是而非的功能验证。主要原因是这类实验的基本原理太简单，随便看个文献就能模仿编造。正因如此，也把非编码RNA研究从自然基金热点中逐渐剥离。
但有一个方向，造假者却不常涉足，那就是表观遗传学。之所以会出现这个现象，因为表观遗传学实验做起来相对“专业”多了，并且还没有绝对的“套路”可循，稍有差池，这一行中眼光毒辣的审稿人都不会给通过，想蒙混发一篇文章难的多。
也正是如此，“表观遗传学+热门疾病”申请国基金仍是不错的一个策略。
今天分享一篇表观遗传学研究相关的论文，准确说是组蛋白甲基化修饰调控前列腺癌耐药相关的研究：“H3K9 methylation drives resistance to androgen receptor-antagonist therapy in prostate cancer”，这篇论文于2022年5月18日发表在PNAS上，这个杂志不用过多介绍了，虽然影响因子刚过10分，但不管是哪个领域的研究人员，在国内能在这个杂志上发一篇研究论文，足够申请两个国自然了；即便那些在二十分普通杂志上发论文的大佬，在你面前也是个业余研究人员。
原文链接：https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.2114324119
背景介绍
这项研究的背景比较清晰：首先，靶向雄激素受体信号转导是治疗晚期前列腺癌的重要策略，但临床常发生前列腺癌对此治疗产生抗性的情况。
其次，组蛋白甲基化修饰可以调控特定基因的表达，使细胞发生不同的特性（比如耐药）。其中，H3K9me1 和 H3K9me2 由 H3K9 二甲基转移酶、常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶 1 和 2（EHMT1 和 EHMT2）动态调节；H3K9 的单甲基化和二甲基化也有助于 DNA 甲基化标记在 CpG 岛的沉积，进一步帮助基因沉默。而H3K9me3 修饰由组蛋白甲基转移酶 SUV39H1、SUV39H2 和 SETDB1 催化。
此外，用慢病毒（携带巨细胞病毒CMV启动子）感染细胞，因为慢病毒嵌合进基因组时插入位点不同，所以可以生成数百万个不同类型的细胞，将这些细胞进行筛选，其中可能产生“耐药”细胞。作者正是用这种方法“诱导产生”耐药细胞。
主要结果
1、正向遗传学方法确定增加的H3K9甲基化是Enz（强效雄激素受体阻滞剂）抗性的驱动因素
做出这个结果的核心是筛选到抗性细胞，当然，也是文章开始的核心结果，如图1A所示，将病毒转导至目的细胞中，然后病毒基因会随机嵌合到染色体不同位置，偶然情况下就会激活具有抗性的基因。
图1A，耐药细胞筛选模式图
2、Enz抗性细胞中H3K9me3转移酶和阅读器基因/蛋白表达量上调
当然，筛选出的耐药细胞EnzR的 H3K9 二甲基和三甲基转移酶（SETDB1、SUV39H1 和 SUV39H2）和 H3K9 甲基阅读器（CBX1 和 CBX5）水平显著增加，同时 H3K9 去甲基化酶下调（图1H）。
图1H，耐药细胞部分蛋白表达差异
3、H3K9甲基化介导对Enz的抗性
为证明耐药是不是由H3K9甲基化介导的，作者直接将H3K9甲基化修饰相关的蛋白过表达并构建稳转细胞系，结果显示这些细胞有明显的耐药活性（图2C）。而敲除这些蛋白的细胞系，则表现出相反的结果（图2F）。
图2C，2F，过表达/敲低H3K9修饰相关的蛋白能够影响细胞的耐药。
4、Enz抗性细胞中的H3K9me3修饰增加
初步研究了H3K9甲基化在协助细胞耐药的功能后，那么耐药细胞中的H3K9me3真的含量增高了吗？染色质免疫沉淀实验和CHIP-seq实验明确了这个疑问，显示Enz抗性细胞中的H3K9me3修饰增加(图3A)。
图3A，Enz抗性细胞中的H3K9me3修饰增加
5、Enz激活的内源性dsRNA触发IFN刺激和细胞死亡
耐药的机理无非是让细胞免于死亡，那这些细胞通常是经何种途径死亡的呢？经作者检测发现，长期的Enz治疗能够诱导dsRNA产生，进一步是STAT1 和 STAT3 的磷酸化，与 ISG 的表达配对。这些 IFN 反应被 MAVS 或 IFNAR1 的敲低完全阻断，并且dsRNA 传感的中断也削弱了 MAVS 敲低中细胞对 Enz 的敏感性，更显著的是，在 IFNAR1 敲低细胞中，表明病毒模拟受体在 Enz 介导的细胞毒性中起主要作用（图略）。
6、Enz 诱导的 GR 上调由 dsRNA 介导的 IFN 刺激触发
研究发现阻断 IFN 级联也有效地降低了 GR 蛋白（图 3 G）和转录物NR3C1。通过poly I:C(激活IFN)刺激细胞，发现以剂量依赖性的方式刺激ISG的转录，这些结果可以推测GR上调是Enz介导的IFN信号传导的下游。
图3G，阻断IFN能够降低GR蛋白表达
7、H3K9me3 调节 Enz 诱导的 RE 的抗性
由于H3K9的高甲基化是抗雄性激素抗性必须的，因此作者检测了一系列H3K9me3表达和抗性相关的指标，在临床样本中也发现了耐药性肿瘤中 SUV39H1/H2 和 MDA5负相关（图5C）。
图5C SUV39H1/H2 和 MDA5 结合的RNA量之间负相关
小结
Enz 处理诱导重复元件的去抑制。随后将它们的转录物加工成可以结合并激活 RIG-I 样受体 (RLR) 的 dsRNA，从而导致 MAVS 激活。MAVS 激活触发IFN介导的病毒模拟反应，导致CRPC细胞的生长抑制和细胞毒性。GR上调是Enz诱导的炎症信号通路的标志物。EnzR细胞通过增加抑制性标记（如H3K9-三甲基化）在特定RE上的沉积并抑制其活化，在表观遗传水平上适应逃避病毒模拟（模式图）。
转自：“学术查”微信公众号
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