CRISPR-Cas9介导的基因组编辑依赖于PAM识别来启动DNA展开。PAM突变可以消除Cas9结合并禁止编辑。
2022年10月21日，武汉大学张楹团队在Molecular Cell（IF=19）在线发表题为“DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near PAMless cleavage by thermophilic Cas9”的研究论文，该研究表明DNA拓扑结构调节PAM-Cas9相互作用和DNA展开，通过嗜热Cas9实现近乎无 PAM的切割。该研究从Alicyclobacillus tengchongensis中鉴定出Cas9，其PAM相互作用可以通过DNA拓扑结构进行强有力的调节。AtCas9具有N4CNNN和N4RNNA的弛豫PAM (R =A/G)，能够结合但不能分裂PAMs突变的靶标。当PAM突变的DNA处于缠绕拓扑结构中时，AtCas9表现出增强的结合亲和力和高切割活性。
在机制上，AtCas9具有独特的环基序，该基序停靠在DNA主凹槽中，并且这种相互作用可以通过DNA拓扑结构进行调节。更重要的是，AtCas9对大肠杆菌中的超螺旋质粒进行了近乎无PAM的编辑。在哺乳动物细胞中，AtCas9表现出广泛的PAM偏好，以高达72%的效率编辑质粒，并在四个内源性位点上进行有效的碱基编辑，代表了近乎无PAM编辑的潜在强大工具。
另外，2022年10月6日，美国麻省总医院Benjamin P. Kleinstiver团队在Nature Biotechnology 杂志在线发表题为“Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests”的研究论文，该研究利用近无PAM的SpCas9变体，被命名为SpRY，作为一种通用的DNA切割工具，应用于各种克隆。通过使用超过130种gRNAs (guide RNAs) 对多种PAMs进行SpRY DNA消化 (SpRY DNA digests, SpRYgests)，发现SpRY在体外无需PAM，可以在几乎任何序列上切割DNA，包括与野生型SpCas9不可切割的位点。总之，SpRYgests受益于精确的DNA断裂以改善各种DNA工程应用（点击阅读）。
90%的古生菌和40%的细菌中存在有规则间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白(CRISPR-Cas9)系统，它们作为适应性免疫机制保护宿主免受核酸入侵。CRISPR-Cas9系统包含CRISPR阵列，由相同的重复序列组成，与从外来入侵者获得的独特序列交错作为“间隔”，其相邻的cas基因作为其主要成分。当外源DNA入侵时，CRISPR阵列被转录并加工成CRISPR RNA (crRNA)。Cas蛋白在crRNA和反式激活RNA (tracrRNA)的引导下，作用于切割与crRNA互补的靶DNA。
为了区分自我和非自我，CRISPR系统开发了一种位于入侵序列中的原间隔相邻基序(PAM)的序列偏好。不同cas的PAM序列是不同的。PAM的识别和结合在DNA局部展开和随后的切割中是必不可少的。目前的DNA展开模型表明，Cas9搜索并结合到PAM位点上，然后形成一个从PAM位点延伸的定向R环。Cas9的PAM相互作用(PI)结构域与PAM碱基和脱氧核糖-磷酸盐骨架形成几个氢键，作为锚点(TS)启动目标链的展开。
PAM识别和结合后，通过gRNA的间隔子与TS之间的碱基配对，使双链DNA (dsDNA)完全展开的能力是Cas9启动切割活性的主要决定因素。PAM的突变阻断了它与Cas9的PI结构域的相互作用，从而取消了DNA展开。DNA展开可以由DNA中的负或正扭矩调节。先前的研究表明，当PAM存在时，超螺旋DNA可以促进DNA展开，从而增强Cas9的切割动力学。然而，DNA拓扑结构是否在调节PAM的识别和结合中起作用还不得而知。
机理模式图（图源自Molecular Cell ）
在有特征的CRISPR-Cas9系统中，II型Cas9蛋白-特别是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-是最健壮的，在基因组编辑中被广泛应用。SpCas9在可编程单导向RNA (sgRNA)系统的引导下，有效地在NGG PAM (N =A, T, C，或G)邻近的序列上切割目标DNA，并导致钝端双链断裂。基于SpCas9，单碱基编辑器和引导编辑器等新技术能够实现一个或多个DNA碱基对从一个到另一个的位点特异性转换。这些新工具带来了开发新疗法的巨大兴趣，由于大多数遗传疾病是由点突变和小的缺失/插入引起的，纠正这些突变是最有效的治疗方法。
由于突变位点的不灵活性，单碱基编辑器和引导编辑器受限于一个限制性的编辑窗口。因此，PAM要求已成为识别高效gRNAs的主要障碍。为了增加SpCas9的靶向范围，一些研究使用蛋白质工程策略将PAM放宽到NG或RY (R = A或G, Y = C或T) ，它们总共只覆盖了~56%的序列。除了蛋白质工程，Mining Natural Orthologs 还发现了一组具有不同PAMs的Cas蛋白质。虽然这些变异对扩大Cas蛋白的靶向范围有一定的作用，但大多数非PAMs携带的靶点仍然是高效基因组编辑的一个限制。
在这里，该研究从嗜热菌Alicyclobacillus tengchongensis 和A. hesperidum 中鉴定了两种新的II-C型Cas9酶，这两种Cas9酶对生理负超螺旋的dsDNA表现出近乎无PAM的切割，当有突变的PAM超螺旋时，切割高达95%，但对线性对应物没有切割。更重要的是，该研究发现嗜热的AtCas9在哺乳动物细胞中具有较低的脱靶效应，并在大肠杆菌(E. coli)中表现出近乎无PAM的超螺旋质粒切割。
原文链接：
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(22)00953-4
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