【摘要】
本研究成功实现了活体水平上AIEgens对胞内分枝杆菌的高效标记及其对宿主细胞感染过程的实时无创连续荧光示踪，且AIEgens的光动力性能，有效解决了分枝杆菌耐药性的问题，不仅为分子设计合成提供了具有借鉴意义的优化参考，也为结核及耐药结核感染提供新型抗菌治疗策略。
【研究内容简介】
由结核分枝杆菌（MTB）引起的结核病（TB）具有较高的感染率和死亡率，是发展中国家目前面临的重大公共卫生威胁。Mtb是一种通过气溶胶液滴而传播的细胞内病原体，首要影响肺部，最终播散至其他器官。其发病机制主要概括为肺泡巨噬细胞吞噬Mtb后，通过包含吞噬体的溶酶体降解消除病原体，未被杀灭的Mtb在巨噬细胞内存活并复制，扩散至邻近未活化的巨噬细胞从而形成继发感染灶。常规诊断结核病的实验室方法各有其缺点而无法满足临床需求，如痰涂片镜检对结核病诊断敏感性的可变性很大，基于Mtb培养的方法需要4～8周，并在实际临床中不可避免地出现假阴性结果，诊断TB的分子生物学检测方法复杂性高且花费高昂，在资源受限地区未得到临床常规应用。在WHO结核病治疗指南中，目前对药物敏感性结核病的标准治疗方案是4种一线药物联合治疗6个月以上。长期使用多种药物和药物性肝损伤（DILI）的风险可能导致抗结核治疗中断，甚至发生耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药TB（XDR-TB）。另外，潜伏性结核病感染（LTBI）可再激活发展为活动性感染，使结核病治疗变得更加困难。因此，快速可靠的TB诊断治疗对于控制传播和缩短治疗持续时间至关重要。
近日，唐本忠院士、上海市公共卫生临床中心施裕新教授团队彭琛副研究员、深圳大学王东教授团队合作报道了一种基于离子型聚集导发光探针（AIEgens）的简单有效的策略用于分枝杆菌的高效荧光标记示踪和杀菌治疗。在本研究中，选取了两种具有不同功能的阳离子型AIEgens（TTVP和TTPy），以海洋分枝杆菌（M.m）作为典型的分枝杆菌品系，研究了不同电荷的AIEgens对于M.m在感染宿主细胞过程中荧光标记示踪能力的差异性，同时选取斑马鱼作为模式动物，同时，模拟结核分枝杆菌在人体内的感染过程，探索了M.m在活体动物模型上对宿主细胞的可视化感染及治疗过程。本研究成功实现了活体水平上AIEgens对海洋分枝杆菌的高效标记及其对宿主细胞感染过程的实时、无创、连续荧光示踪。而AIEgens本身具有的光动力性能，可以有效解决分枝杆菌耐药性的问题，本研究不仅为分子设计合成提供了具有借鉴意义的优化参考，也为结核及耐药结核感染提供新型抗菌治疗策略。同时，通过对阳离子型AIE探针的调控设计，研究不同D-π-A结构（不同电荷及官能团）对其分子荧光及PDT效果的影响。
本研究选择合成了两种带正电荷的AIE-PS，命名为TTVP和TTPy，以评估不同离子功能基团对于AIEgens在分枝杆菌对宿主细胞感染过程的荧光标记效果和抗菌性能的差异性。为此，选择与结核杆菌具有类似结构的海洋分枝杆菌作为模型菌种，以结核病研究中的新兴模型斑马鱼作为模型动物，系统地评估了TTVP和TTPy之间的离子功能关系。结果揭示，分子的荧光性能与其分子内共轭程度呈正比关系，而AIEgens正电性越强，其与M.m的结合能力更强，从而有助于更高效的荧光标记示踪。
Figure 1. Photophysical property and bacterial imaging investigation of TTVP and TTPy. The picture of M.m incubated with TTVP (A) or TTPy (B) at different concentrations for 30 minutes under 365 nm UV light. PL spectra of M.m with or without TTVP (C) or TTPy (D)-labeled (λex: 489 nm). The bright field, fluorescence, and merged confocal images of M.m-Cerulean stained with TTVP (E) or TTPy (F). λex: 405 nm, 1.5% laser power, λem: 498-558 nm; λex: 488 nm, 3% laser power, λem: 664-750 nm; scale bar: 5 μm. Flow cytometry analysis of M.m-Cerulean stained with TTVP (G) or TTPy (H), respectively.
TTVP和TTPy在ROS性能方面均表现出极高的选择性抗菌效果，均能快速高效地实现对M.m的杀伤效果，且在保证优良抗菌性能的同时，对正常细胞安全无害。同时，系统的研究证实，TTVP与 TTPy相比，具有更加优异的荧光标记示踪和抗菌效，而这为后续AIEgens在生物体内结核感染方面的安全应用提供了有效的理论支持。
Figure 2.In vitro photodynamic antibacterial study. The representative photographs plates of M.m treated by TTVP (A) or TTPy (B) at a concentration range of 0-0.5 μM in different irradiation conditions. The killing efficiency of TTVP (C) and TTPy (D) at a concentration range of 0-0.5 μM against M.m in different irradiation conditions. [* for comparison among different concentrations of TTVP or TTPy (0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 μM) versus TTVP or TTPy (0 μM) in light and dark conditions, # for comparison between light and dark at the same concentration]. Photodynamic intracellular M.m killing ability after incubating with of TTVP or TTPy (E) for 20 minutes without or with light irradiation. (I: Dark; II: 20 mW/cm2, 30 minutes, once; III: 20 mW/cm2, 30 minutes, twice; IV: 40 mW/cm2, 30 minutes, once; V: 40 mW/cm2, 30 minutes, twice). Statistical analysis of photodynamic intracellular M.m killing data (F) (* for comparison among TTVP or TTPy-labeledM.m under different lighting conditions versus without TTVP or TTPy, # for comparison among TTVP and TTPy-labeled M.m under the same lighting conditions versus without TTVP or TTPy, and δ used to compare TTVP to TTPy-labeled M.m under the same lighting conditions). SEM images of M.m (G) with or without TTVP and TTPy after receiving various lighting conditions. Scale bar: 2.5 μm.
Figure 3. In vivo imaging and photodynamic antibacterial study. Bright field and fluorescence images of the zebrafish embryo lesion progression at 1, 3, 5, and 7 dpi after infection with M.m-Cerulean in the dark (A). Brightfield and fluorescence images of the zebrafish embryo lesion progression at 1, 3, 5, and 7 dpi after infection with TTVP-labeled (B) and TTPy-labeled (C) M.m-Cerulean in the dark. λex: 405 nm, 1.5% laser power, λem: 498-558 nm; λex: 488 nm, 3% laser power, λem: 664-750 nm; Scale: 300 μm. M.m-Cerulean can be visualized (D) and quantified (E) in infected zebrafish embryos. The values shown represent an average of three independent biological experiments, with 15 embryos per group in each experiment. (F) of zebrafish embryos with different treatments shown in (E), with 30 embryos per group. Vertical section of zebrafish embryos that have been stained with acid-fast (G). The asterisks indicate the aggregates of spreading M.m, and the arrow indicates the infection tissue that protrudes on the dorsal side of the fish. The red circle shows small secondary granuloma-like structures from the primary infection. Scale bar: 50 μm (left) and 15 μm (right).
本课题不仅揭示了AIEgens的离子-功能关系，证实了带更多正电荷的AIEgens与M.m的结合力更强，其荧光标记示踪和光动力杀伤之间存在密切的相关性。也将胞内致病性感染的分枝杆菌同步高效荧光标记示踪与精准杀菌变成了现实，这为后续抗结核光敏剂设计提供了有价值的参考和借鉴，也为结核及耐药结核感染提供了潜在的新型抗菌诊疗策略。相关工作以“Seeing is Believing: Efficiency Evaluation of Multifunctional Ionic-dependent AIEgens for Tuberculosis”为题发表在Biomaterials上。文章第一作者为复旦大学附属上海市公共卫生临床中心研究生黄雪妮和初程圣泽，通讯作者为香港中文大学（深圳）唐本忠院士、复旦大学附属上海市公共卫生临床中心彭琛副研究员/施裕新教授和深圳大学王东教授。
【课题组简介】
香港中文大学（深圳）唐本忠教授：中国科学院院士、发展中国家科学院院士、亚太材料科学院院士、国际生物材料科学与工程学会联合会生物材料科学与工程Fellow、英国皇家化学会会士、国家自然科学基金基础科学中心项目负责人，曾任广东省引进创新科研团队带头人、973计划项目首席科学家、国家自然科学基金重大项目负责人。现任中国生物材料学会常务理事、中国化学会常务理事、华南理工大学和德国威利出版社（Wiley）联合期刊Aggregate主编、《中国科学：化学》副主编、《化学进展》副主编、Adv. Polym. Sci. （Springer）编辑等。在国内外顶尖杂志上发表论文1600余篇，他引十三万余次，H-index为163。曾先后获得多项荣誉及奖励，如国家自然科学一等奖（2017），何梁何利科学与技术进步奖（2017）、第27届夸瑞兹密国际科学奖（2014）、美国化学会高分子学术报告奖（2012）、国家自然科学二等奖（2007）、裘槎高级研究成就奖（2007）、中国化学会高分子基础研究王葆仁奖（2007）和爱思唯尔出版社冯新德聚合物奖（2007）等。
复旦大学附属上海市公共卫生临床中心彭琛副研究员：复旦大学附属上海市公共卫生临床中心副研究员，2018年—2022年于香港科技大学进行访问学习和博士后研究，师从唐本忠院士，主要研究方向为基于医用生物材料的基础-临床结合转化研究，包括分子影像诊疗和抗菌抗感染研究。以第一作者/通讯作者在Adv. Funct. Mater.、Adv Sci. Biomaterials等期刊上发表SCI论文50余篇，10篇论文入选“ESI高被引论文”H-index为34。
复旦大学附属上海市公共卫生临床中心施裕新教授：复旦大学附属上海市公共卫生临床中心副院长，上海新发与再现传染病研究所副所长，上海市公共卫生临床中心感染影像研究所副所长/感染影像诊疗中心主任，复旦大学上海医学院影像医学系副主任。中华医学会放射学分会传染病专业委员会副主任委员，中华医学会放射学分会心胸专业委员会委员，中华医学会结核病分会影像诊断专委会副主任委员，中国研究型医院学会感染与炎症专委会副主任委员。主持国家自然科学基金、上海市和江苏省科研课题9项，参与国家“十一五”、“十二五”、“十三五”重大传染病专项，并主持子课题，参与美国NIH课题，并担任中方负责人。
深圳大学王东教授：深圳大学特聘教授，深圳大学材料学院副院长，深圳大学AIE研究中心主任（执行）。以第一作者/通讯作者在Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Adv. Mater.、Angew Chem. Int. Ed.、Matter、Chem. Rev.、Chem. Soc. Rev.、Acc. Chem. Res.、Adv. Funct. Mater.、Biomaterials等期刊上发表SCI论文160篇，影响因子大于10的论文98篇。16篇论文入选“ESI高被引论文”，论文共被引用9400余次。获得国家优秀青年基金、广东省杰出青年基金、深圳市优秀青年基金项目。入选Biomaterial Science期刊、Science China Chemistry期刊、Chemical Society Reviews期刊新锐科学家。主要研究方向：聚集诱导发光材料的开发，及其在化学传感、生物成像和治疗等方面的应用。
资助信息
该研究得到了国家自然科学基金委（82172029; 81801977; 82102116; 82302335）的支持。
原文信息
Xueni Huang,#, Chengshengze Chu,#, Chunzi Shi, Jiulong Zhang, Bo Yan, Fei Shan, Dong Wang,*, Yuxin Shi,*, Chen Peng,*, Ben Zhong Tang,*.Seeing is Believing: Efficiency Evaluation of Multifunctional Ionic-dependent AIEgens for Tuberculosis. Biomaterials 2023, 302, 122301。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122301
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