导读
疏肝脂片（SGZT）来源于著名的中药柴胡汤，可用于治疗肝脏疾病，但其药效机制尚待评价。本研究旨在剖析SGZT治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的作用机制，筛选其有效成分；首先对SGZT的主要成分进行了定性分析；采用高脂饮食建立大鼠NAFLD模型；采用血清生化指标和肝脏病理学分析，评价SGZT治疗NAFLD的药效学。为了探讨其药效机制，我们采用蛋白质组学和代谢组学分析。蛋白质印迹法用于验证显著差异蛋白的表达；用游离脂肪酸（FFA）和SGZT的主要成分处理L02细胞，建立体外NAFLD细胞模型，揭示SGZT药效物质。SGZT中检测到12种成分，根据血清生化指标和肝脏病理分析结果，SGZT可有效治疗NAFLD。结合生物信息学分析结果，我们发现在SGZT处理的大鼠肝脏样本中，133种差异表达的蛋白质被逆转。PPAR信号通路、类固醇生物合成、胆固醇代谢和脂肪酸代谢中的重要蛋白质主要被调节以维持胆固醇稳态和改善脂质代谢。SGZT还影响大鼠肝脏中的各种代谢产物，包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和牛磺酸。此外，SGZT中的主要成分（橙皮苷、虎杖苷、柚皮苷、大黄素、特女贞苷、柴胡皂苷A）和一种代谢产物（白藜芦醇）可显著减少FFA诱导的细胞内脂质积聚。SGZT有效治疗NAFLD，PPAR-γ、Acsl4、Plin2和Fads1可能是主要靶点。Fads1-EPA/DHA-PPAR-γ可能是潜在的药效学途径。体外细胞实验表明，SGZT的主要成分及其代谢产物，如橙皮苷、虎杖苷、柚皮苷、大黄素、特女贞苷、柴胡皂苷A和白藜芦醇，可能是其主要的药效成分。
亮点：
1. 疏肝脂片可有效治疗非酒精性脂肪肝；
2. PPAR-γ、Acsl4、Plin2和Fads1可能是药效学靶点；
3. 疏肝脂片具有调节体内代谢产物变化的作用；
4. 疏肝脂片的主要成分在体外具有降脂作用。
论文ID
原名：Study on the mechanism of Shuganzhi Tablet against nonalcoholic fatty liver disease and lipid regulation effects of its main substances in vitro
译名：疏肝脂片抗非酒精性脂肪肝的作用机制及主要物质体外调脂作用的研究
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.06
通讯作者：韩涵，张彤
通讯作者单位：上海中医药大学
实验设计
实验结果
1. SGZT主要成分的定性分析
我们在SGZT的甲醇提取物中检测到大多数已知的活性成分，正负离子模式下的总离子流图如图1所示，特征成分包括柴胡皂苷A、柚皮苷、橙皮苷、白术内脂I、虎杖苷、大黄素、特女贞苷、齐墩果酸、熊果酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和三七皂苷R1。表1列出了每种成分的来源。
图1 LC-MS/MS法对SGZT的主要成分进行定性分析
A、负离子模式下的总离子色谱图；B、正离子模式下的总离子色谱图。（A）柴胡皂苷A；（B）柚皮苷；（C）橙皮苷；（D）白术内脂Ⅰ；（E）虎杖苷；（F）大黄素；（G）特女贞苷；（H）齐墩果酸；（I）熊果酸；（J）人参皂苷Rg1；（K）人参皂苷Re和（L）三七皂苷R1。
表1 SGZT主要成分的定性分析及来源
2. SGZT对高脂饮食（HFD）诱导大鼠NAFLD模型的治疗作用
我们从大鼠体重、血清生化指标和肝脏病理学染色的变化来评价SGZT对NAFLD的治疗作用。
在高脂肪饮食的情况下，在整个实验期间给予SGZT前后大鼠的体重如图2A所示。在实验的最后一周，与正常（NC）组大鼠相比，HFD组大鼠的体重显著增加（P < 0.01）；与HFD组大鼠相比，SGZT（200mg/kg）干预后大鼠体重显著下降（P<0.01），HFD+SGZT 400组大鼠体重也有显著下降（P＜0.01），HFD+辛伐他汀(SV)组和HFD+SGZT 100组大鼠平均体重下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）（图2B）。与NC组相比，HFD组血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL-C）水平显著升高（P < 0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）水平明显下降（P<0.01）；与HFD组相比，HFD+SGZT 100组TC水平较低（P < 0.05），TG和LDL-C水平也明显下降（P < 0.01），HDL-C水平明显升高（P<0.01）；HFD+SGZT 200和HFD+SGZT 400组血清TC、TG和LDL-C均显著降低（P < 0.01），HDL-C显著升高（P < 0.01）；SV给药后大鼠血清TG与HFD组比较无显著性差异（P > 0.05），其他各项指标均明显逆转（P < 0.01）（图2C–F）。
图2 大NC、HFD、HFD+SV、HFD+SGZT 100、HFD+SGZT 200和HFD+SGZT 400组大鼠体重和血清生化指标的变化
（A）整个实验期间动物体重的变化；（B）每组大鼠在实验开始和最后一周的体重；（C）不同组血清TC含量；（D）不同组血清TG含量；（E）不同组血清HDL-C含量；（F）不同组血清LDL-C含量。与NC组比较##P＜0.01；与HFD组相比*P < 0.05，**P<0.01,（n = 10）。
H&E染色结果（图3A）显示NC组大鼠肝组织结构正常，主要表现为肝小叶排列规则，分裂明显。肝细胞和肝窦呈放射状排列在中央静脉周围，肝细胞形状饱满、圆形。肝窦无明显扩张或压迫。HFD组肝细胞脂肪变性广泛分布于肝组织的中央静脉、门静脉周围和肝实质，细胞质中弥漫着数量和大小不等的圆形液泡。与HFD组相比，HFD+SV组、HFD+SGZT 100、200和400组的肝脏脂肪变性呈中度或少量，圆形液泡明显减少。
油红O染色结果（图3B）显示NC组大鼠肝组织中没有橙色脂滴，HFD组大鼠肝组织脂滴大面积分布，脂滴呈橙红色，细胞核呈蓝色。HFD+SV组和HFD+SGZT 100、200和400组的肝组织染色结果显示，与HFD组相比，染色脂滴明显改善。
图3 NC、HFD、HFD+SV、HFD+SGZT 100、HFD+SGZT 200和HFD+SGZT 400组肝组织的H&E染色和油红O染色结果
（A）不同组H&E染色的代表性图像；（B）不同组油红O染色的代表性图像。
3.NAFLD和SGZT处理后差异表达蛋白的TMT定量蛋白质组学
SGZT对HFD诱导的NAFLD具有治疗作用。我们采用TMT标记定量技术对NC、HFD、HFD+SV和HFD+SGZT组大鼠（n=3）的肝脏样品进行分析。我们筛选HFD组与NC组、HFD+SGZT组与HFD组、和HFD+SV组与HFD组的差异表达蛋白，并在此基础上进行生物信息学分析。与NC组相比，HFD组共有301个差异表达蛋白，其中137个下调蛋白，164个上调蛋白。与HFD组相比，HFD+SGZT组共有308个差异表达蛋白，其中209个下调蛋白，99个上调蛋白。SGZT干预后的差异表达蛋白比SV处理后的差异蛋白多。SV处理后发现183个差异表达蛋白，包括45个下调蛋白和138个上调蛋白（图S1）。在SGZT干预后，相对于疾病模型，总共133种蛋白质的表达被逆转（表S1）。统计分析结果表明，一些重要的NAFLD相关蛋白（如PPAR-γ、Plin2、Pck1、Hmgcs1、Acsl4、Fdft1、Dhcr7、Cyp7a1、Hsd17b7、Lipa、Acat2和Fads1）的蛋白表达存在显著差异（P < 0.05），SGZT可以显著逆转这些蛋白的表达。
4. 生物信息学分析
SGZT干预后，与HFD组相比，我们对表达逆转的差异表达蛋白进行GO注释富集分析和KEGG通路分析。根据图4A–C，差异表达蛋白的生物学过程主要涉及有机物代谢过程、小分子代谢过程、生物合成过程和对有机物的反应，分子功能主要与催化活性、离子结合、小分子结合、氧化还原酶活性和转移酶活性有关，细胞成分主要分布于细胞质、细胞器、内膜系统、内质网和线粒体。
根据图4D所示的结果，差异表达蛋白主要富集于类固醇生物合成（Dhcr7、Fdft1、Lipa、Dhcr24、Hsd17b7、Tm7sf2、Sqle、Msmo1）、萜类骨架生物合成、PPAR信号通路（PPAR-γ、Pck1、Plin2、Acsl4、Hmgcs1、Fads2、Cyp7a1）、胆汁分泌（Ephx1、Ugt1a1、Sult2a1、Slco1a1、Cyp7a1、Slc22a8），胆固醇代谢（Apoa4、Lipa、Angptl3、Lipc、Cyp7a1）和脂肪酸代谢（Acsl4、Acat2、Fads1、Ppt1、Fads2）。
图4 给予SGZT后逆转差异蛋白的GO注释富集分析和KEGG通路分析的气泡图
（A）生物过程分析；（B）分子功能分析；（C）细胞成分分析；（D）KEGG通路分析。
5. 不同代谢产物对NAFLD和SGZT处理反应的代谢组学
我们对肝脏样品的UHPLC-MS/MS数据进行预处理，在负离子模式下获得8617个变量，而在正离子模式下存在8300个变量。将肝脏样本数据（预处理）导入SIMCA 14.1软件中进行整体主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。三维PCA图如图S2所示，在正负离子模式下，NC组和HFD+SGZT组的肝脏样本与HFD组有很好的区别。正离子和负离子模式下肝脏样本的OPLS-DA评分图如图S3所示，两组样本完全分离。
如表S2所示，我们总结了大鼠肝脏样本中各组之间的重要差异代谢产物。与NC组相比，HFD组有18种差异代谢产物，其中11种在SV给药后逆转，SGZT给药后还发现了包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和牛磺酸在内的11种差异代谢产物，所有这些都在HFD组的基础上具有逆转作用。
图5 NC、HFD、HFD+SV、HFD+SGZT 100、HFD+SGZT 200和HFD+SGZT 400组PPAR-γ、Plin2、Pck1、Hmgcs1、Acsl4、Fdft1、Dhcr7、Cyp7a1、Hsd17b7、Lipa、Acat2和Fads1的蛋白质印迹分析
（A）免疫印迹条带图；（B）PPAR-γ蛋白相对水平；（C）Plin2蛋白相对水平；（D）Pck1蛋白相对水平；（E）Hmgcs1蛋白相对水平；（F）Acsl4蛋白相对水平；（G）Fdft1蛋白相对水平；（H）Dhcr7蛋白相对水平；（I）Cyp7a1蛋白相对水平；（J）Hsd17b7蛋白相对水平；（K）Lipa蛋白相对水平；（L）Acat2蛋白相对水平；（M）Fads1蛋白相对水平。与NC组比较##P＜0.01；与HFD组相比*P < 0.05，**P<0.01（n = 3）。
6. SGZT改善NAFLD靶蛋白的调控与验证
如图5所示，为了验证上述重要的NAFLD相关蛋白（PPAR-γ、Plin2、Pck1、Hmgcs1、Acsl4、Fdft1、Dhcr7、Cyp7a1、Hsd17b7、Lipa、Acat2、Fads1）在SGZT干预后的表达变化，我们通过蛋白质水平的蛋白质印迹验证了结果，并发现其与蛋白质组学分析一致。与模型组相比，SGZT给药后可以有效逆转这些蛋白质的表达，不同浓度的SGZT对蛋白质表达的影响不同。
7. SGZT的主要成分或代谢物可减轻FFA诱导的L02 细胞脂质堆积
如图6A所示，FFA浓度为0.25 mM，0.5 mM，0.75 mM和1 mM对细胞活性没有显著影响，因此选择1 mM作为建模浓度。在图6B中，我们确定SV（40、80、100 μM）、橙皮苷（40、80、100 μM）、虎杖苷（40、80、100 μM）、柚皮苷（40、80、100 μM）、大黄素（10、20、40 μM），特女贞苷（40、80、100 μM），柴胡皂苷A（5，10，20 μM）和白藜芦醇（1，5，10 μM）对与1mM 游离脂肪酸共同孵育的L02细胞存活率没有显著影响 。分别将上述七种组分与FFA共同孵育以处理L02 细胞，根据图6C所示的TG测定结果，橙皮苷（40、80、100 μM）、虎杖苷（40，80 μM）、柚皮苷（80100 μM），大黄素（10，20 μM），特女贞苷（40、80、100 μM），柴胡皂苷A（5，10 μM）和白藜芦醇（1，5，10 μM）可降低FFA引起的TG含量升高。同时，图7所示的油红O染色结果也反映了这些成分减轻了在 FFA诱导的L02细胞的脂质积累。
图6 L02细胞活力检测和TG检测
（A）用0.25 mM，0.5 mM，0.75 mM和1 mM FFA处理的L02细胞活力；（B）用SV（40、80、100 μM）、橙皮苷（40、80、100 μM）、虎杖苷（40、80、100 μM）、柚皮苷（40、80、100 μM）、大黄素（10、20、40 μM），特女贞苷（40、80、100 μM），柴胡皂苷A（5，10，20 μM）和白藜芦醇（1，5，10 μM）处理与FFA共孵育的L02细胞的细胞活力 ；（C）用SV（100 μM）、橙皮苷（40、80、100 μM）、虎杖苷（40、80、100 μM）、柚皮苷（40、80、100 μM）、大黄素（10、20、40 μM），特女贞苷（40、80、100 μM），柴胡皂苷A（5，10，20 μM）和白藜芦醇（1，5，10 μM）处理与1 mM游离脂肪酸共孵育的L02细胞的TG。与NC组比较，##P＜0.01，#P＜0.05；与HFD组相比，**P＜0.01，*P＜0.05（n = 3）。
图7 分别用SV(100 μM)、橙皮苷(40、80、100 μM)、虎杖苷(40、80、100 μM)、柚皮苷(40、80、100 μM)、大黄素(10、20、40 μM)、特女贞苷(40、80、100 μM)、柴胡皂苷A(5、10、20 μM)和白藜芦醇(1、5、10 μM)处理与1 mM FFA共孵育的L02细胞的油红O染色
讨论
HFD可导致脂质在肝脏和其他组织中过度积聚，从而诱发伴随非酒精性脂肪性肝病发展的肥胖和代谢性疾病，与胰岛素抵抗、内质网应激、自噬干扰、线粒体功能障碍等多种因素有关，而NAFLD发病机制的确定仍需进一步研究。在本实验中，我们通过长期喂食HFD在大鼠中模拟人NAFLD的形成。随着喂养时间的增加，大鼠的体重逐渐增加。SGZT干预后，体重变化表明，SGZT可以抑制高脂饮食引起的显著增重。TG、TC、HDL-C、LDL-C的生化指标可以反映大鼠的血脂水平，已有研究表明，血清TG、TC和LDL-C水平升高与NAFLD的形成密切相关，肝活检H&E染色和油红O染色可以更直观地了解肝组织中的脂质沉积。根据药效学实验结果，大鼠体内TG、TC和LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高，肝内脂滴积聚也显著改善，表明SGZT对NAFLD的治疗作用显著。
为了揭示SGZT治疗HFD诱导的NAFLD的机制，我们对肝脏样品进行了蛋白质组学分析，并利用分子生物技术验证了一些重要差异蛋白的表达。最后得出结论，SGZT可以调节PPAR信号通路、类固醇生物合成、胆固醇代谢、脂肪酸代谢等通路中重要功能蛋白的表达，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（Pck1）、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶1（Hmgcs1）、法尼基二磷酸法尼基转移酶1（Fdft1）、7-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr7）、羟基类固醇17β脱氢酶7（Hsd17b7），乙酰辅酶A乙酰转移酶2（Acat2）、脂肪酸去饱和酶1（Fads1）、脂滴包被蛋白2（Plin2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（Acsl4）、细胞色素P450家族7亚家族A成员1（Cyp7a1）和脂肪酶A（Lipa），从而在NAFLD的治疗中发挥治疗作用。
过氧化物酶体增殖物激活受体是核激素受体的一个超家族，包括PPAR-α、PPAR-β/δ和PPAR-γ，其在脂质代谢和葡萄糖代谢中起重要作用。PPAR-γ作为调节脂质代谢的关键因子，对脂肪细胞的功能和分化至关重要。一些研究得出结论，PPAR-γ激动剂如罗格列酮可以作为药物来研究调节脂肪生成的潜在机制，它可以提高患者的血浆TC、HDL-C和LDL-C水平。在本研究中，给予SGZT上调了肝脏PPAR-γ的表达水平，这可能通过发挥PPAR-γ激动剂如罗格列酮的作用来增加胰岛素敏感性，从而调节体内脂质代谢并改善NAFLD。
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶胞质同工酶可分为两类，即由Pck1编码的PEPCK-C和由Pck2编码的PEPCK-M，它们与肥胖、脂肪肝等疾病的发病机制有关，PPAR-γ与Pck1有一定的相关性。Pck1是糖异生的关键酶，研究表明，当Pck1的表达受到抑制时，喂食HFD的小鼠会诱导胰岛素抵抗，并增加脂肪肝的发病率。我们推测SGZT给药后PPAR-γ表达的上调可以调节其下游蛋白Pck1表达的上调，从而改善胰岛素抵抗并发挥其药理作用。
Plin2是一种调节脂滴代谢的蛋白质，与脂质储存功能密切相关。研究表明，在HFD喂养的NAFLD小鼠模型中，Plin2也可能是通过调节脂滴降解来减轻NAFLD的潜在靶点。Okumura T指出，HFD可以上调Plin2的表达并诱导肝脏脂肪变性。根据本研究的结果，HFD诱导的Plin2的蛋白质变化与上述一致，给予SGZT可以逆转其疾病模型的蛋白质表达。Plin2可能是SGZT的潜在靶点。
Acsl4作为一种多不饱和脂肪酸代谢同工酶，在类固醇合成、炎症、细胞死亡等生物反应中发挥一定的功能。PPAR-γ激动剂如罗格列酮已被提及可抑制Acsl4活性，但这种作用可能与PPAR-γ无关。据推测，在本研究中，SGZT的成分可能在模型大鼠的肝脏中具有类似的作用，并在调节Acsl4中发挥作用，从而减少脂质的产生。
此外，SGZT给药可逆转模型组大鼠肝脏样品中Hmgcs1、Acat2和Fads1的表达，达到上调作用，与文献结果一致。Hmgcs1是一种编码胆固醇生物合成途径的蛋白质。胆固醇酰基转移酶包括两种由不同基因编码的同工酶，即Acat1和Acat2。作为一种胆固醇酯化酶，Acat2在肝组织中起着维持细胞胆固醇稳态的作用。脂肪酸去饱和酶是治疗脂肪肝的潜在靶点，Fads1是哺乳动物中唯一能够产生多不饱和脂肪酸（如EPA和DHA）的Δ-5脂肪酸去饱和度酶，从而减少肝组织中甘油三酯的积累。
Cyp7a1作为一种重要的胆汁酸合成酶，主要起到清除体内胆固醇的作用。Lipa基因编码一种溶酶体酸性脂肪酶，可水解胆固醇酯和甘油三酯，产生胆固醇和游离脂肪酸。Fdft1基因编码角鲨烯合成酶，一种参与胆固醇合成的调节因子，研究表明Fdft1可能是治疗NAFLD的潜在靶点。Dhcr7可以催化7-脱氢胆固醇转化为胆固醇，这在胆固醇合成的最后一步中发挥作用。Hsd17b7作为一种3-酮甾体还原酶在胆固醇生物合成中也起着重要作用。Cyp7a1和Lipa都是在胆固醇代谢途径中发挥作用的蛋白质。总之，根据蛋白质组学结果，SGZT的药效学途径之一可能与体内胆固醇稳态的维持有关。
我们利用代谢组学技术对大鼠肝脏样品进行分析，筛选出重要的差异代谢产物。疾病模型大鼠肝脏中的油酸水平升高，研究证据表明，NAFLD患者的油酸水平显著升高，油酸可诱导肝脏脂肪变性的发展。关于牛磺酸在各种疾病中的作用已有大量研究，表明牛磺酸在体内具有重要的研究意义。牛磺酸对非酒精性脂肪肝损伤具有预防和治疗作用，当高胆固醇饮食导致胆固醇升高时，牛磺酸可以降低胆固醇水平。SGZT可以提高肝组织中牛磺酸的水平，从而减轻肝脏中的脂质沉积，治疗NAFLD。干预给药SGZT后，肝脏中EPA和DHA水平升高，与HFD组相比有所逆转。EPA和DHA属于ω-3脂肪酸，可以减少肝组织中甘油三酯的积累和脂肪组织中脂肪因子的释放。基于体内重要的蛋白质和关键代谢产物，我们使用KEGG数据库分析了蛋白质分子与肝脏代谢产物之间的相关性，发现蛋白质分子Fads1与代谢产物EPA和DHA在同一途径（不饱和脂肪酸的生物合成）中富集，其变化趋势和相互作用与文献一致。此外，EPA和DHA也可作为PPAR-γ的天然激活剂。据推测，该药物效应具有潜在的作用途径Fads1-EPA/DHA-PPAR-γ，但仍需进一步验证。在本研究中，SGZT干预后可能的药效机制如图8所示。
图8 SGZT干预后可能的药效机制
ALA，α-亚麻酸；EPA，二十碳五烯酸；DHA，二十二碳六烯酸；PUFA，多不饱和脂肪酸；CE，胆固醇酯；FC，游离胆固醇；BA，胆汁酸。红色箭头表示体内蛋白质表达上调或代谢物含量增加，而蓝色箭头表示蛋白质表达下调。
根据以往的研究，SGZT中所含的橙皮苷、虎杖苷、柚皮苷、大黄素、特女贞苷和柴胡皂苷A是吸收到血液中的主要成分，白藜芦醇是虎杖苷在体内的重要代谢产物。因此，我们将这7种可能是SGZT主要药效成分作为体外药效研究的主要对象，并将其作为SGZT治疗NAFLD的药效物质。至于每种单体成分或相互作用的药效机制，还需要进一步的研究来揭示SGZT治疗NAFLD的潜在机制。
结论
总的来说，SGZT对大鼠NAFLD的治疗具有显著的药效学作用，并能显著改善肝组织中脂质的积累。SGZT干预后，疾病模型大鼠PPAR-γ和Pck1水平上调，Acsl4和Plin2水平下调，改善了体内脂质代谢。同时，Fads1可以调节多不饱和脂肪酸的形成，肝脏EPA和DHA水平升高，从而减少肝组织中甘油三酯的沉积和体内脂肪因子的释放。我们推测PPAR-γ、Acsl4、Plin2和Fads1可能是SGZT干预后药物作用的主要靶点。Fads1-EPA/DHA-PPAR-γ可能是潜在的药效学途径。同时，SGZT中所含的橙皮苷、虎杖苷、柚皮苷、大黄素、特女贞苷和柴胡皂苷A及其代谢产物白藜芦醇可有效改善FFA诱导的L02细胞脂质蓄积，或者是SGZT的药效学成分。然而，还需要进一步的研究来揭示和验证其药效机制。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123006487#fig4
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