Nature Methods | 碱基编辑进入“迷你时代”，杨辉团队开发出基于Cas9祖先IscB的微型碱基编辑器

作为一种小型RNA引导的内切酶，IscB被认为是Cas9的祖先，并具有相似的功能。IscB的大小不到Cas9的一半，因此更适合体内递送。然而，IscB在真核细胞中的编辑效率较差，限制了其在体内的应用。

2023年5月25日，辉大基因杨辉及周英思共同通讯（韩鼎毅，王一凡，肖庆全及张海南为论文共同第一作者）在Nature Methods（IF=48）在线发表了题为“Development of miniature base editors using engineered IscB nickase”的研究论文，该研究报道了OgeuIscB及其相应的ωRNA的工程设计，以开发一个在哺乳动物系统中高效的IscB系统，命名为enIscB。

通过将enIscB与T5外切酶(T5E)融合，该研究发现enIscB-T5E具有与SpG Cas9相当的靶向效率，同时在人类细胞中表现出较低的染色体易位效应。此外，通过将胞嘧啶或腺苷脱氨酶与enIscB缺失酶融合，该研究生成了微型iscb衍生碱基编辑器(miBEs)，显示出强大的编辑效率(高达92%)，可用来诱导DNA碱基转换。总的来说，该研究的工作建立了enIscB-T5E和miBEs作为基因组编辑的通用工具。

基于Cas9缺口酶的DNA碱基编辑系统可以不依赖于细胞周期进行编辑，不需要进行双链DNA的切割，这使得Cas9碱基编辑系统在非分裂细胞的体内编辑中不可或缺，在基础研究和基因治疗方面取得了很大进展。然而，Cas9碱基编辑器的大尺寸被认为是基于病毒载体(如腺相关病毒)的基因编辑应用的挑战。其他从Cas12和TnpB衍生的小碱基编辑工具也有报道。

然而，它们在哺乳动物细胞中的碱基编辑效率受到限制，因为将Cas12或TnpB设计成Cas9D10A缺口酶(切割目标链)等蛋白进行碱基编辑的可行性较低。最近，大小最小化的cas9衍生碱基编辑器也被成功地打包到单个腺相关病毒中，这仍然局限于A•T到G•C的编辑。因此，开发更小的Cas9替代品对体内基因组编辑具有重要的潜在意义。

A-to-I和C-to-T的enIscB碱基编辑器（图源自Nature Methods ）

IscB被认为是Cas9的祖先蛋白，其大小约为500个氨基酸。最近，有报道称IscB是一种可编程RNA引导的内切酶，它与γ - RNA组装，并介导类似Cas9的DNA裂解，具有CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA (tracrRNA)。Cas9和IscB蛋白都含有HNH和RuvC结构域，分别切割靶DNA链和非靶DNA链。然而，IscB在哺乳动物细胞中的编辑效率较差已经成为一个明显的限制。

该研究设计了ωRNA和OgeuIscB的蛋白，发现工程化IscB (enIscB)系统在哺乳动物细胞中具有与Cas9相当的强大编辑活性。此外，该研究开发了基于enIscB nickase的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器(分别命名为miABE和miCBE)，具有强大的碱基编辑效率，极大地促进了基因编辑领域的发展。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01898-9

转自：“iNature”微信公众号

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