NBT（IF=68）| 中国科学院高彩霞等团队使用PrimeRoot编辑器，精确整合植物基因组中的大DNA序列

在植物育种和合成生物学中，需要染色体插入技术来促进所需的农艺性状和信号传导和代谢途径的引入。

2023年4月24日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞等团队在Nature Biotechnology（IF=68）在线发表题为“Precise integration of large DNA sequences in plant genomes using PrimeRoot editors”的研究论文，该研究表明使用PrimeRoot编辑器精确整合植物基因组中的大DNA序列。该研究描述了PrimeRoot，一种基因组编辑方法，用于在植物中产生靶向精确的大DNA插入。第三代PrimeRoot编辑器采用优化的先导编辑指导RNA设计，增强型植物先导编辑器和重组酶，能够将高达11.1千碱基的DNA精确插入植物基因组。该研究展示了使用PrimeRoot在水稻中准确地引入基因调控元件。

该研究还将一个包含PigmR的基因盒整合到Kitaake水稻的预测基因组安全港位点，该基因盒由Act1启动子驱动，具有水稻稻瘟病抗性，并获得了含有预期插入的编辑植株，效率为6.3%。作者发现这些水稻的抗稻瘟病能力增强了。这些结果表明PrimeRoot是一种很有前途的方法，可以在植物中精确插入大片段的DNA。

CRISPR基因组编辑依赖于单引导RNA (sgRNA)来编程活细胞中特定基因组位点的Cas核酸酶结合和DNA切割。最近发展的精确基因组编辑技术，如碱基编辑和引物编辑，允许在不需要DNA双链断裂(DSB)中间体的情况下进行精确的靶向基因组修饰。这些技术极大地促进了农作物研究中的基因研究和分子育种。靶向DNA插入也可以通过基于CRISPR的方法在植物中产生。供体DNA可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)插入Cas9 DNA的DSB位点。

然而，即使使用化学修饰的供体DNA，NHEJ途径也是极其不精确的，因为插入的供体片段的末端包含随机的DNA碱基插入和缺失(indels)。在HDR中，尽管由于供体DNA和宿主基因组之间的同源性，某些插入事件在DSB上可以精确定位，但HDR方法在高等植物中效率极低，通常依赖于一个可选择的标记来丰富罕见的插入事件。此外，由于NHEJ和HDR都依赖于DSB，因此需要绕过DSB的方法，因为DSB会导致许多不希望和不可预测的事件，例如大量缺失，染色体易位和染色体裂缝。

先导编辑(Prime editing，PE)是一种精密的基因组编辑技术，能够在不形成DSB的情况下产生碱基变化和短DNA索引。虽然先导编辑器已被广泛应用于不同物种，如人类细胞、小鼠、水稻、小麦、玉米等，但由于无法插入大的DNA片段，先导编辑受到了限制。产生大插入的另一种方法依赖于位点特异性重组酶(SSRs)的使用。SSRs首先识别被称为重组酶位点(RSs)的特定序列，并利用它们进行突触形成。在重组过程中，重组酶产生重组结构并进行链交换，最终使SSRs能够在RSs对之间进行DNA逆转录、易位、缺失和插入。虽然酪氨酸SSRs催化的重组事件通常是可逆的，而丝氨酸SSRs催化的重组事件通常是单向的，但Cre的突变重组酶位点降低了可逆性，这使得酪氨酸SSRs的应用更加灵活和广泛。

PrimeRoot结合了植物优化重组酶和增强的植物PE来创建靶向DNA插入（图源自Nature Biotechnology ）

由于SSRs介导的重组不涉及内源性DNA修复，因此编辑效率通常很好，即使在真核细胞中也是如此，因此这些工具被广泛用于设计基因插入和重排。然而，SSR复合物识别特定的重组酶位点，而这些位点在大多数期望的插入位点中是缺失的，因此对RS的需求严重限制了SSR在许多高等物种中的应用。TwinPE+Bxb1和PASTE是依靠PE和重组将大的DNA供体片段插入哺乳动物基因组的新方法，但这些方法需要进一步优化。

综上，PrimeRoot提供了许多机会来设计数量性状变化，性状堆叠等，所有这些都有助于产生关键的农艺性状。未来的应用，如调控元件的插入、内源基因的标记和新的转基因的引入，将依赖于精确的基因组编辑技术来实现精确的分子作物育种和推进植物合成生物学。

高彩霞课题组博士生孙超、雷源和李帛树为论文共同第一作者，高彩霞研究员与北京齐禾生科生物科技有限公司的Kevin Tianmeng Zhao博士为论文共同通讯作者。中国农业大学刘俊教授、中科院遗传发育所王延鹏研究员参与了该研究。该研究得到国家重点研发计划项目、中国科学院战略重点项目、中国农业农村部和国家自然科学基金委等的经费资助。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01769-w

转自：“iNature”微信公众号

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