Plant Com | 华中农大、中棉所合作开发基于CRISPR/dCas9的转录激活（基因敲高）系统助力棉花种质创新

定向调控内源基因以实现解析目标基因表达网络一直是植物研究领域的热点。随着CRISPR/Cas技术的发展，RNA引导的CRISPR激活（CRISPRa）系统在动植物中被开发应用，即利用dCas9核酸酶融合转录激活剂可以调节内源基因的转录，实现基因的定向上调。基因转录的精确、上调正在成为功能基因组学研究、分子育种和种质创新的一个有效解决方案。然而，目前还没有关于CRISPR/dCas9转录激活系统在棉花中应用的报道。

2023年4月13日，Plant Communications在线发表了华中农大、中棉所合作的题为“Developing an efficient CRISPR/dCas9-TV derived transcriptional activation system to create three novel cotton germplasm materials”的论文，该文利用基于CRISPR/dCas9系统的转录激活（基因敲高）系统调控内源基因实现了棉花的种质创新。

https://doi.org/10.1016/j.xplc.2023.100600

研究中作者基于优化的CRISPR/dCas9-TV系统实现了棉花内源基因GhTULP34和GhTLP19的高效稳健上调，GhTULP34基因表达最高稳定上调了35.5倍，GhTLP19则最高上调30.5倍。从GhTLP19（sgRNA1~10）和GhTULP34（sgRNA11~20）激活效率来看，大多数sgRNAs可以引导dCas9-TV在不同程度上激活报告基因，但sgRNAs的靶标位点对转录激活的效率显示出明显影响。为了测试当植物受到渗透胁迫时，基因GhTULP34的上调是否能抑制气孔关闭，用400mM甘露醇处理转基因株系后，TULP#5植株的气孔开放数明显多于对照，GhTULP34的定向上调提高了棉花的抗旱能力。

在创制优质种质资源的导向下，作者利用该系统成功激活了基因GhPAPID，其表达量最高上调了41.7倍。有意思的是，GhPAPID的激活材料在植物组织培养过程中其愈伤组织出现了明显的红色/紫色表型，该基因可以作为棉花遗传转化过程中一个良好的报告基因。此外，该基因的转基因植株叶片、茎、枝条和花瓣呈现出明显的红/紫色，检测发现不同的转基因株系中的原花青素（PA）和花青素含量显著提高，这一结果与这些植物的转录水平增加是一致的。这一研究为创造天然彩色棉花提供了一个有潜力的新方向，未来可以利用该系统结合组织特异性启动子来同时定向上调类黄酮途径中的多个基因（如GhTT2和GhCHS）实现棉花纤维颜色的改变。

除草剂抗性是转基因作物的一个主要功能特性，培育抗除草剂作物具有重要的经济效益和明显的环境效益。作者通过该系统定向激活了棉花内源的GhEPSPS基因，成功获得了表达量上调2.9至33.5倍不等的转基因植株。对转基因T0代植株进行草甘膦处理发现，转基因株系表现出良好的草甘膦抗性，并且抗性可以从T0亲本植物稳定遗传到T1后代。

总而言之，该研究证明CRISPR/dCas9-TV系统是一种高效的基因"敲高"策略，基于该系统成功激活并创制三种棉花种质材料（彩色、草甘膦抗性和耐旱种质），为耐受性种质的分子育种和种质资源创新提供一个新的研究策略。

华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室博士生余露和中国农科院棉花研究所博士栗战帅为该论文的第一作者；金双侠教授、朱龙付教授、中国农科院棉花研究所范术丽研究员为共同通讯作者；张献龙教授指导了该课题的实施开展。该研究得到了海南省三亚崖州湾科技城联合项目、湖北洪山实验室和国家自然科学基金等项目的资助。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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