水凝胶纳米颗粒墨水！通过MRI对组织工程支架实现高精度可视化

以下文章来源于EngineeringForLife ，作者EFL

水凝胶作为细胞支架广泛应用于生物医学领域，植入体内后细胞支架观察以及长期监测成为一个难题。然而，在大多数生物医学成像方式，如磁共振成像(MRI)，细胞支架的对比度很差。MRI是低密度、富水组织高分辨率可视化首选成像技术。在MRI中增强水凝胶对比度可用“阴性”造影剂进行，这种造影剂会产生一些图像伪影，阻碍植入物轮廓的描绘。近日，来自加拿大魁北克大学的Marc-André Fortin教授团队进行了纳米颗粒墨水通过MRI对组织工程支架高精度可视化的相关研究。研究成果以“A Nanoparticle Ink Allowing the High Precision Visualization of Tissue Engineered Scaffolds by MRI”为题于2023年03月25日发表在《Small》上。

本文开发了一种超小氧化铁纳米颗粒(USPION)并集成到生物相容性海藻酸盐水凝胶内，用于细胞支架应用。测量磁水凝胶弛豫特性，以及生物相容性和MR-visibility(T1加权模式;在体外和体内)。在小鼠模型中进行为期2周MR随访研究，显示没有图像伪影，并且随着时间推移保留了“阳性”对比，使得MRI可以非常精确描绘组织移植物。最后，开发了一种便于接枝圈定和几何符合性评估的3D轮廓绘制程序，应用于倒置模板藻酸盐孔隙网络。这一概念验证建立了使用USPIONs油墨高可见性方法揭示精确工程水凝胶结构的可能性。

图1 USPIONs合成和使用倒置模板铸造技术制备含有流体通道对比增强水凝胶的示意图

本文开发了一种含有USPIONs的核磁共振可见海藻酸盐水凝胶方案，可以对复杂形状的水凝胶支架进行几何评估。油酸稳定USPIONs核心尺寸为5纳米，采用热分解技术合成，然后采用PEG衍生高效配体替代方法。具有低分散性的PEG稳定USPIONs完全定性（尺寸、表面配体、磁性），显示出非常强的T1加权对比特性，接近于基于钆对比剂所达到的效果。然后将USPIONs纳入海藻酸盐水凝胶中，并进行完整松弛测量和磁性表征程序，清楚显示USPIONs一旦充分均匀分散在水凝胶中，就能保持其正面对比度特性。海藻酸-USPION水凝胶的可见性在体内（小鼠模型）进行了实验，并对移植物进行为期2周的跟踪。通过测量血液中的炎症标志物（体内实验），以及暴露在水凝胶中的脂肪源性干/基质细胞（ASCs），研究了植入物的生物相容性。最后，通过MRI测量USPION海藻酸盐复杂、亚毫米级的结构，通过使用水凝胶中布满定向孔的方法，在海藻酸盐物体中产生倒置模板孔网络来测量精确度。总之本文验证了USPIONs作为细胞支架体积和形状添加剂在体内的潜力。

图2 油酸稳定USPIONs (USPIONs-oa)在己烷中粒径分析及peg稳定USPIONs (USPIONs-peg)在水中粒径分析

PEG化的USPIONs通过热分解技术制备后，然后用PEG衍生的氧化膦（PO-PEG）进行配体交换。配体交换前后USPIONs大小发生变化。与传统PEG化程序相比，通过这种技术实现更高的铁浓度，通过目测正己烷-水两相悬浮液，确认配体交换成功，氧化铁纳米颗粒（红橙色）首先分散在正己烷中，然后分散在水中。USPIONs-PEG平均尺寸（4.9±0.9纳米）反映其在T1加权相MRI中作为"阳性"造影剂的潜力（<5纳米）。低多分散性分布表明配体交换过程没有影响胶体平均尺寸。通过动态光散射（DLS）测量，USPIONs-OA和USPIONs-PEG流体动力学直径分别为8.9±0.2和20±0.6纳米。配体取代后流体力学尺寸的增加归因于PO-PEG的体积，因为其有三个线性PEG链。傅里叶变换红外（FTIR）光谱揭示配体在颗粒表面接枝情况，而TGA分析用来测量PEG接枝的密度。在所有FTIR光谱中，两个样品都观察到了典型的波幅，证实了氧化铁核心的存在。通过TGA估计USPIONs-OA配体数量为147.8/USPION，USPIONs-PEG为46.1/USPION。对两种胶体磁化曲线测量显示超顺磁性。

图3 松弛特性和NMRD谱表征

通过测量USPIONs胶体和水凝胶中USPIONs的核磁弛豫分散（NMRD）曲线，进一步完善弛豫分析。结果显示两种环境（水与海藻酸盐水凝胶）下类似的松弛特性，当USPIONs在水凝胶内时，其数值略有下降。在低场区（0.1-1MHz）USPIONs-PEG和水凝胶+USPIONs-PEG的纵向松弛率分别为9.57和7.54mm-1s。低场时的r1受氧化铁晶体各向异性能量支配。USPIONs-PEG水凝胶+USPIONs-PEG的r1值在1MHz时略有下降，表明各向异性能量较低。在中到高的磁网强度下，发生居里松弛，产生一个峰值（居里峰），然后在>30兆赫时出现激进的r1下降。这是SPIONs胶体悬液典型特征。两个样品都遵循r1和r2值沿磁场强度演变趋势：r1曲线在低磁场强度下相对恒定，然后在30MHz时下降，而r2曲线迅速增加，然后在高磁场强度下饱和。水凝胶的r2值增加得更明显。表明在高于100兆赫的磁场中使用USPIONs补充水凝胶的可能限制。在临床磁场强度（1-3T），水凝胶浓度为0-2%的情况下，r2/r1比率的变化非常有限，因此可以在T1加权MRI中对水凝胶进行正面对比。海藻酸浓度对信号有轻微的影响，交联可能限制了氧化铁颗粒附近的水分子数量。

图4 在体内进行14天体积保留研究

在健康BALB/c小鼠体内注射USPION-海藻酸水凝胶，通过MRI监测其体积。皮肤下可以清楚地看到一个球形或椭圆形的隆起。在此之后，通过手术小心翼翼地切除海藻酸盐植入物，必要时切掉一大部分皮肤和周围的肌肉。在每次手术后对每个样本进行直接目测，可以确认从MRI图像中预期的剩余胶体体积。研究期间，含有USPIONs的海藻酸水凝胶在扫描中清楚看到为小鼠皮肤下的明亮区域。没有USPIONs的海藻酸盐水凝胶被周围脂肪组织划分为暗区。3天后水凝胶体积减少，可能是由于周围组织吸收了很大一部分水含量，以及海藻酸盐复合Ca2+离子释放到微环境中。3天后，体积稳定到实验结束。从MRI扫描中提取的轮廓在两个实验组中遵循相同的趋势。在实验的第14天，海藻酸盐注射液的残留量为28.6±1.7%，而海藻酸盐+USPIONs组的残留量为33.1±2.5%。补充USPIONs的海藻酸盐的体积保持率较高，主要由于USPIONs表面存在PEG链，海藻酸盐链可以与之相互作用，以及颗粒表面的铁离子可能轻微溶解，这可以增强海藻酸盐的交联。

图5 利用消耗性碳水化合物晶格模板四步法生产核磁共振可见水凝胶支架示意图

为实现完全植入海藻酸盐-USPION孔隙结构，首先用定制3D打印机打印出消耗性碳水化合物3D晶格网络。打印过程中，根据计算机辅助数据（CAD）文件中编程的方向，生成了自支撑的细丝。由此产生3D打印碳水化合物模板外部尺寸为20×14×10mm3，内部晶格由八层交替的四条纵向和四条横向的1mm直径的长丝组成。第二步，对3D打印的碳水化合物晶格进行CT扫描几何评估，参数的完美控制实达到碳水化合物3D打印高保真度的必要条件。因此，CT扫描是开发具有薄而小特征高保真3D形状的一个重要工具。第三步，使用含有USPIONs海藻酸盐生产出MRI可见含孔水凝胶结构，在体内作为细胞支架植入。在海藻酸盐中加入GDL后，直接将水凝胶快速混合，使用注射器小心注入碳水化合物模板。用T1加权自旋回波序列的核磁共振成像来观察所产生的水凝胶，USPIONs-PEG产生强烈正向对比，可以清楚看到水凝胶结构内部的通道。此外，流体通道完整性可以在轴向和矢状MRI横断面上观察。最后，CAD碳水化合物模板图像通过CT扫描获得3D打印碳水化合物晶格的图像，以及对比度增强水凝胶MRI图像，在最初碳水化合物晶格和水凝胶中产生通道（蓝色）之间发现一个完美的几何匹配。如果没有USPIONs产生的强烈对比度增强就无法实现，总之，在海藻酸盐水凝胶中加入USPIONs可以快速有效地评估格子模板之间几何保真度，以及由此产生的孔隙网络。

本文结果表明USPIONs用作造影剂可通过核磁共振观察海藻酸盐水凝胶支架的情况。该方法在再生医学中可以大量应用，特别是在需要MRI跟踪的实验里。USPIONs在T加权MRI中作为"阳性"造影剂。通过高效PEG衍生化的氧化膦配体稳定结构。对USPIONs-PEG悬浮液和USPIONs-海藻酸盐水凝胶进行了测磁、测弛和NMRD测量，然后进行了为期30天的体外MRI CNR测量。通过T1加权MRI对海藻酸盐支架体内可视化进行14天跟踪，同时，通过炎症标志物和组织学分析测量证实这些USPION-海藻酸盐支架生物相容性。最后为将来完全以体内植入海藻酸盐-USPION孔隙结构为目标研究做准备，使用碳水化合物三维晶格网制造含有海藻酸盐孔隙的结构。辅以USPIONs以实现MRI对比度增强。用USPION-海藻酸盐制备概念证明，该方法可以揭示MRI精确设计的水凝胶结构，用作组织工程细胞支架。总的来说，本研究证实含USPIONs生物相容性水凝胶方案作为一种功能性工具，具有在再生医学中划定和跟踪细胞支架的潜力。

文章来源：

https://doi.org/10.1002/smll.202206644

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